(河北大学医学院，河北 保定 071000)

空气中的颗粒物质(particulate matter，PM)是一种复杂的混合物，含有许多成分，包括酸、有机化学物质和金属[1]。世界卫生组织估计，全球每年有超过一百万过早死亡病例与空气污染物有关[2]。大量的研究[3-5]表明，短期接触细颗粒物可使颗粒物进入血液循环，引起肺和全身的氧化应激以及炎症反应，同时还可导致心脏神经系统失调。近年来越来越多的研究[6-7]表明，吸入颗粒物会导致呼吸道和心血管疾病。近几十年来，由于工业化、城市化和机动化的快速发展，国内的空气质量显著恶化，然而现阶段关于颗粒物的研究主要集中在欧美等发达地区[8-10]。中国虽然已开展关于空气污染物对身体健康的研究，但现阶段的研究大多集中在PM2.5的影响[11-12]，关于直径小于0.1 nm的超细颗粒对心肌梗死后心功能的影响很少报道，本研究基于前期实验结果，选择空气中含量较多的超细纳米锌颗粒作为实验对象，研究其对心肌梗死后小鼠心脏结构功能的影响，为进一步认识空气污染对心血管系统的危害及治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性ICR小鼠36只, 6～8周龄, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司, 许可证号为SCXK (京) 2016-0006。

1.2 主要仪器和试剂

小动物呼吸/麻醉系统(R407，深圳瑞沃德生命科技有限公司)；小动物超声成像系统(Vevo2100，加拿大FUJIFILM VisualSonics公司)；激光共聚焦显微镜(A1,日本Nikon公司)；雾化气溶胶发生器(402AI，江苏鱼跃医疗设备有限公司)；心电检测系统(SP2006，北京软隆科技有限公司)；恒流泵(FCY5015,成都气海有限公司)；麦芽凝集素(Wheat Germ Agglutinin，WGA)(美国Life Technologies公司)；凋亡试剂盒(瑞士Roche公司)。

1.3 小鼠心肌梗死模型的制作

6～8周SPF级雄性ICR小鼠36只，适应性饲养1周后，随机分为正常对照组、心梗组以及吸入组，每组12只。随后对心梗组和吸入组进行心肌梗死造模，小鼠行气管插管术，1.5%异氟烷维持麻醉，SP2006心电监测系统监测小鼠心电，小鼠仰卧位固定，胸部备皮，沿胸骨左缘离断第三第四肋，打开胸腔，剥开心包，结扎左前降支。心电检测结果显示ST段抬高，则说明心肌梗死手术成功，逐层缝合切口，动物苏醒后送饲养室饲养，自由饮食饮水。术后每天肌注8万单位青霉素，连续3 d，以防止切口感染。

1.4 小鼠呼吸控制

经心肌梗死手术后1周，实施呼吸控制8周，每周4 d，每天5 h。将小鼠置于特殊设计的通风盒内，通过雾化气溶胶发生器对盒内的空气成分进行调节，通过雾化过程，使吸入组小鼠吸入超细纳米锌颗粒，颗粒浓度500 μg/m3。同时其余两组也置于通风盒中，吸入雾化蒸馏水。

1.5 小鼠心功能检测

在实施呼吸控制实验8周后，使用异氟烷麻醉小鼠，仰卧位固定小鼠，使用小动物超声检测小鼠心脏的左心室收缩期内径(LVEDs)、左心室舒张期内径(LVEDd)、左心室收缩期容积(LVEVs)、左心室舒张期容积(LVEVd)、每搏输出量(SV)、射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)、左心室前壁收缩期厚度(LVAWs)、左心室前壁舒张期厚度(LVAWd)、左心室后壁收缩期厚度(LVPWs)、左心室后壁舒张期厚度(LVPWd)。

1.6 马松三色法检测心肌胶原含量变化

在超声检测结束后处死小鼠，取出心脏，放入4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋切片，之后脱蜡入水，行马松三色染色，3%氯化汞饱和溶液固定40 min，流水冲洗10 min，0.5%冰乙酸1 s，酸性品红+丽春红2R(1∶2)工作液10 min，0.5%冰乙酸1 s，1%磷钼酸2 s，1%亮绿复染3 min，0.5%冰乙酸I、II 各1 s，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 各2 s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明10 min，最后中性树胶封片。观察心肌细胞胶原含量变化，图像使用Image-Pro plus计算胶原容积分数(心肌胶原纤维面积/心肌组织总面积×100%)。

1.7 免疫荧光染色

石蜡切片经常规脱蜡至水，使用pH 6.0柠檬酸盐缓冲液加热20 min修复抗原，自然冷却至室温，PBS清洗3次，每次5 min，0.3%Trition X溶液透化5 min，PBS清洗3次，滴加 50 μg/mL Wheat Germ Agglutinin(WGA)室温避光反应1 h，PBS清洗3次，使用Hoechst染液复染，PBS清洗3次，滴加抗荧光淬灭剂封片观察。每组至少3个独立样本，每个样本至少3个切片，每个切片在400×镜随机下选择5个独立视野进行计数，使用Image-Pro plus细胞大小进行计数。

1.8 TUNEL法检测细胞凋亡

石蜡切片经常规脱蜡至水，按照试剂盒说明书操作，染色结束后使用Hoechst对细胞核进行复染，观察心肌细胞凋亡情况。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 超细纳米锌颗粒加剧小鼠心功能的恶化

与正常对照组相比，心梗组的LVEDs、LVEDd、LVEVs、LVEVd均显著性增大(P<0.05)，同时EF、FS均显著降低(P<0.05)，小鼠心室扩张，心功能降低。与心梗组比较，吸入组的LVEDs、LVEDd、LVEVs均显著性增大(P<0.05)，同时SV、EF、FS、LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd均显著降低(P<0.05)，说明吸入超细纳米锌颗粒后小鼠心室扩张加剧，心功能降低，见图1、表1。

图1 各组小鼠室壁运动M型超声心动图

表1 实施呼吸控制实验8周后各组小鼠心功能比较

组别FS/%LVAWs/mmLVAWd/mmLVPWs/mmLVPWd/mm正常对照组32.57 ± 1.441.63 ± 0.051.09 ± 0.041.44 ± 0.061.139 ± 0.03心梗组24.10 ± 2.16a1.65 ± 0.06a 1.18 ± 0.06a1.44 ± 0.07a1.221 ± 0.05a吸入组13.35 ± 1.65b1.10 ± 0.09b0.81 ± 0.06b1.01 ± 0.07b0.897 ± 0.05bF28.20020.81013.04014.26014.820P0.0000.0000.0000.0000.000

与正常对照组比较，aP<0.05；与心梗组比较，bP<0.05。

2.2 超细纳米锌颗粒增加小鼠心肌胶原含量

与正常对照组相比，心梗组与吸入组均有明显的胶原沉积，差异有统计学意义(P<0.05)，与心梗组对比，吸入组心肌细胞间的胶原含量更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)，可见吸入超细纳米锌颗粒加剧心梗后胶原含量的沉积，同时加剧左心室的心室病理性重构，见图2、表2。

图2 各组小鼠左心室马松三色染色(标尺为100 μm)

表2 各组小鼠心肌胶原含量

与正常对照组比较，aP<0.05；与心梗组比较，bP<0.05。

2.3 超细纳米锌颗粒对小鼠左心室细胞大小的影响

与正常对照组相比，心梗组的心肌细胞均明显增大，差异有统计学意义(P<0.05)，与心梗组对比，吸入组的心肌细胞显著增大，且差异有统计学意义(P<0.05)。表明吸入超细纳米锌颗粒后使心肌梗死细胞继续增大，加剧心脏病理性重构，见图3。

与正常对照组比较，aP<0.05；与心梗组比较，bP<0.05图3 各组小鼠心肌细胞WGA染色(标尺为50μm)

表3 各组小鼠400倍镜下心肌细胞数

与正常对照组比较，aP<0.05；与心梗组比较，bP<0.05。

2.4 超细纳米锌颗粒对小鼠心肌细胞凋亡的影响

与正常对照组比较，心梗组与吸入组细胞凋亡显著升高(P<0.05)，与心梗组对比，吸入组梗死区域细胞凋亡数明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。表明吸入超细纳米锌颗粒能促使心脏梗死区的细胞凋亡，见图4。

与正常对照组比较，aP<0.05；与心梗组比较，bP<0.05图4 各组小鼠心肌细胞凋亡情况(标尺为200μm)

表4 各组小鼠心肌细胞凋亡率

与正常对照组比较，aP<0.05；与心梗组比较，bP<0.05。

3 讨论

雾霾中的超细颗粒(PM0.1)主要来自化石燃料的燃烧，拥有小体积，大面积，较PM2.5更易产生化学反应[7,13]，心血管临床研究证明PM0.1比PM2.5拥有更严重的危害[14]。研究[15-16]表明，暴露于PM2.5会增加心肌梗死的发病率和病死率，同时PM2.5可以直接沉积在肺部的气道和肺泡中，而较小的PM0.1颗粒甚至可以进入体循环，导致炎症和氧化应激，并导致动脉粥样硬化。近年来，许多临床研究[17-18]证明，暴露在颗粒污染的空气中会增加心肌梗死风险，即使对于心肌梗死的愈后患者，空气污染仍然是心血管疾病的重要风险因素。然而，关于超细颗粒PM0.1对心肌梗死心脏结构功能影响仍有待进一步研究。

空气中的颗粒物质成分复杂，含有多种金属、有机物等。Cozzi等[19]发现，将动物暴露于PM环境中，会引起动物心肌梗死面积增大。同时，Wold等[20]研究发现，即使暴露于小剂量的PM环境中，暴露时长达9个月也足以引起心肌纤维化、微血管炎症、血栓形成和心肌细胞形态改变，导致心脏收缩与舒张功能下降。de Oliveira-Fonoff等[21]证明，暴露于PM环境中可导致心肌细胞凋亡。这些结果表明细颗粒物质通过增加心肌梗死后心肌胶原沉淀、改变心肌细胞形态、诱导细胞凋亡来加剧心肌梗死心脏的病理性重构，这与本结果一致。

在本实验中，暴露在超细纳米锌颗粒的环境中，心肌梗死小鼠左心室SV、EF、FS、LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd降低，同时，LVEDd、LVEDs、LVEVs升高，证明暴露在超细纳米锌颗粒环境中会导致小鼠左心室扩大，心室壁变薄，心脏收缩和舒张功能减退。进一步对心脏组织切片实验研究发现，暴露于超细纳米锌颗粒的小鼠左心室正常心肌减少，凋亡细胞增多，胶原含量明显增多，心肌纤维化加剧，同时WGA对心肌细胞膜染色结果显示，吸入超细纳米锌颗粒使得心肌梗死心肌细胞增大，细胞排列错乱，进一步证明吸入超细纳米锌加剧左心室病理性重构。本研究结果证明了空气中的超细纳米锌颗粒对心肌梗死心脏的结构性重塑起着重要作用，为制定针对性的政策来治理空气污染提供了理论依据。