李海波，XING Baoshan

人工纳米材料(engineering nanomaterials, ENMs)在空气与水体净化，生物医药、防护化妆品以及电子设备生产等领域得到广泛应用。但是，纳米材料及其产品在生产、使用和处理过程中，通过各种途径进入环境，可能带来难以预料的负面环境影响和生态效应[1]，严重威胁生态系统健康与安全。纳米颗粒作为污染物会随大气沉降、降水和灌溉等进入农田，在土壤环境中迁移和转化，被植物吸收、富集和累积[2-3]，对环境和人体健康带来不同程度的负面影响。

植物作为初级生产者，处于食物链的最低端，是生物蓄积的起点。纳米颗粒通过食物链逐级高位富集，产生生物放大作用，对生物产生毒性效应。研究表明，碳纳米材料用来研究水环境的有机污染物吸附/清除机理，如多环芳烃(PAH)[4-6]，抗生素[7-11]，除草剂[12]等，其中农田大量而广泛使用的除草剂(如阿特拉津)残留时间长，而且污染极具隐蔽性。

关于纳米颗粒生物有效性及毒性的影响的研究还很有限，而关于纳米颗粒与除草剂复合污染机理及其生物毒性的研究更是鲜见报道，因此，研究纳米颗粒对农田土壤-作物系统的生物毒性可为农业生产和农业环境可持续发展提供理论依据。

表1 CNTs的相关性质

注：OD：粒径；SSA：特定表面面积

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试药剂 (1)95%乙醇，SiO2粉，CaCO3粉；(2)5%三氯乙酸(TCA)，0.67%硫代巴比妥酸(TBA)；(3)脯氨酸，3%磺基水杨酸，冰醋酸，甲苯，酸性茚三酮；(4)天然有机质胡敏酸(HA)的提取采用0.1mol/L NaOH溶液，含C 47.4%，含N 1.19%。

1.1.2 供试作物 水稻品种：吉科稻512(SWCNTs)；大豆品种：黑农35(纳米TiO2和纳米ZnO)；吉科黄豆20(SWCNTs)。

1.1.3 纳米颗粒 选用的碳纳米管为多壁碳纳米管(MW)，羟基化多壁碳纳米管(MH)，羧基化多壁碳纳米管(MC)，以及单壁碳纳米管(SW)，其相关性质见表1。

1.2 实验设计与方法

1.2.1 实验设计 (1)MWCNTs实验设计为8个处理(见表2)，3次重复。(2)SWCNTs实验设计为8个处理(见表3)，3次重复。(3)选用的金属氧化物纳米颗粒为纳米TiO2和纳米ZnO，其相关性质见表4。纳米TiO2和纳米ZnO实验设计为6个处理(见表5)，3次重复。

表2 MWCNTs实验设计

表3 SWCNTs实验设计

表4 纳米TiO2 和纳米ZnO的相关性质

注：OD：粒径

表5 纳米TiO2 和纳米ZnO实验设计

图1多壁碳纳米管暴露对水稻幼苗丙二醛含量的影响MW:多壁碳纳米管;MH:羟基化多壁碳纳米管;MC:羧基化多壁碳纳米管,下同

1.2.2 实验方法 (1)叶绿素含量测定：采用95%乙醇提取叶绿体色素，采用分光光度计法在665 nm、649 nm、470 nm下测定吸光度，分别计算鲜样的叶绿素a，b和类胡萝卜素的含量。(2)脯氨酸含量测定：称取水稻幼苗0.5 g，采用3%磺基水杨酸提取，高温下与酸性茚三酮反应，溶解在甲苯中，采用分光光度计法在520 nm下比色，计算鲜重样品的脯氨酸含量。(3)丙二醛(MDA)的测定：称取水稻幼苗0.5 g，提取(5%TCA)，研磨，水浴煮沸(加0.67%TBA)， 取上清液采用分光光度计法在450 nm、532 nm、600 nm下测定吸光度，计算MDA含量。

1.2.3 统计分析 采用SPSS 16.0进行方差分析(ANOVA)和相关分析。

2 结果与分析

2.1 纳米颗粒暴露对作物幼苗丙二醛含量的影响

丙二醛(MDA)是植物细胞膜脂过氧化最重要的产物之一，MDA含量增加会加剧细胞膜的损伤，因此，植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量常作为重要指标。图1显示，随着碳纳米管浓度的增高，丙二醛含量表现为下降趋势，低浓度碳纳米管暴露下表现的尤为明显，可能与碳纳米管在水中的团聚化增加有关，因为碳纳米管具有很强的疏水性。不同浓度MWCNTs暴露后，MDA含量比CK分别增加83%、3%和68%；而不同浓度MHCNTs暴露后，MDA含量比CK分别增加127%、119%和57%；不同浓度MCCNTs暴露后，MDA含量比CK分别增加32%、42%和5%。但碳纳米管经过HA改性后暴露，MDA含量显著低于未经HA改性的处理。ANOVA结果表明，碳纳米管暴露下，不同处理的MDA含量具有显著差异。

单壁碳纳米管(SWCNTs)暴露下，水稻幼苗MDA含量随着SWCNTs浓度增加而增高，在100 mg/L浓度(R5)下达到最高(见图2)，比空白(R1)增加了15.8%。水稻幼苗在高浓度胡敏酸改性SWCNTs(R8，即50 mg /LSW+100 mg/L HA)暴露下，MDA含量比空白降低了10.1%，比添加原样SWCNTs的3个处理(R3、R4、R5)分别降低了15.9%、20.0%和23.0%；胡敏酸改性SWCNTs暴露下，水稻幼苗MDA含量随着胡敏酸浓度的增加而降低。

大豆幼苗在50 mg/L浓度SWCNTs(S4)暴露下MDA含量最高(见图2)，比空白增加了49.5%。大豆幼苗在高浓度胡敏酸改性SWCNTs(S8)暴露下，MDA含量比空白降低了8.9%，比添加原样SWCNTs的3个处理(S3、S4、S5)分别降低了28.2%、39.1%和31.4%；胡敏酸改性SWCNTs暴露下，大豆幼苗MDA含量随着胡敏酸浓度的增加而显著降低。

图2 单壁碳纳米管暴露对水稻及大豆幼苗丙二醛含量的影响

图3 TiO2和ZnO纳米颗粒的暴露对大豆幼苗丙二醛含量的影响

图4 多壁碳纳米管暴露对水稻幼苗脯氨酸含量的影响

图3显示，纳米TiO2与纳米ZnO暴露后提高了大豆幼苗丙二醛(MDA)含量。纳米TiO2暴露下，T1和T2处理MDA含量比CK分别增加了97%和124%，HA改性的纳米颗粒则分别增加54%和36%。纳米ZnO暴露下T1和T2处理MDA含量比CK分别增加了251%和98%，HA改性的纳米颗粒则分别增加113%和40%。ANOVA表明，纳米TiO2与纳米ZnO暴露不同处理间存在显著差异(分别为P=0.006和P=0.008)，在浓度500 mg/L下，纳米ZnO比纳米TiO2的影响较为显著。纳米颗粒吸附HA后，MDA含量显著下降，高浓度下表现更为明显，表明HA具有显著的解除纳米颗粒生物毒性的作用。

2.2 纳米颗粒暴露对作物幼苗脯氨酸含量的影响

图4显示，脯氨酸含量具有随着碳纳米管浓度的增高而增高的趋势，MHCNTs与MCCNTs处理脯氨酸含量增加比较显著，而MWCNTs处理在高浓度(500 mg/L)下脯氨酸含量明显提高。MHCNTs与MWCNTs吸附HA后处理T4，T5，T6组脯氨酸平均含量明显低于对照，不同浓度MCCNTs吸附HA后仍然维持较高水平，而且显著高于未经HA吸附的处理。

SWCNTs及其HA改性颗粒暴露下，不同处理的水稻和大豆幼苗脯氨酸含量具有显著差异(见图5)。在原样SWCNTs暴露下3个处理的水稻幼苗脯氨酸含量比空白分别降低了17.0%、32.2%和24.1%。改性SWCNTs的3个处理的水稻幼苗脯氨酸含量比空白分别降低了31.2%、40.0%和30.9%。改性SWCNTs的3个处理的水稻幼苗脯氨酸含量均低于原样SWCNTs的3个处理，其机理不明。

与水稻相反，大豆幼苗在原样SWCNTs暴露下3个处理的脯氨酸含量比空白分别增加了16.7%、25.3%和9.5%。HA改性SWCNTs的3个处理的大豆幼苗脯氨酸含量比空白则分别增加了4.2%、4.6%和12.4%。HA改性SWCNTs处理的大豆幼苗脯氨酸含量比原样SWCNTs处理有降低的趋势(见图5)。

图6显示，纳米TiO2比纳米ZnO暴露后，大豆幼苗脯氨酸含量有降低的趋势，而纳米颗粒吸附HA后，会缓解这种趋势。纳米TiO2与纳米ZnO对大豆幼苗脯氨酸含量的影响并不显著。

本研究中，纳米颗粒胁迫导致脯氨酸含量下降，可能与供试材料抗逆性低有关，需进一步研究。

图5 单壁碳纳米管暴露对水稻及大豆幼苗脯氨酸含量的影响

图6 TiO2和ZnO纳米颗粒的暴露对大豆幼苗脯氨酸含量的影响

2.3 纳米颗粒暴露对作物幼苗叶绿体色素含量的影响

图7显示，随着碳纳米管浓度的升高，叶绿素a的含量并无明显变化。碳纳米管吸附HA后叶绿素a的含量比碳纳米管原样的平均含量要高，MCCNTs处理叶绿素a含量低于CK，MHCNTs与MWCNTs处理叶绿素a含量的平均值则高于CK。随着碳纳米管浓度的升高，叶绿素b的含量的变化比较复杂。处理T4、T5、T6组加入HA后叶绿素b的含量平均值大于处理T1、T2、T3组，MCCNTs处理叶绿素b含量低于对照，MHCNTs与MWCNTs叶绿素b含量的均值则大于对照。随着碳纳米管浓度的升高，类胡萝卜素的含量无显著变化。

在原样SWCNTs暴露下，随着其浓度的升高，水稻幼苗叶绿体色素含量呈增加的趋势(见图8)。高浓度SWCNTs(R5)暴露下的水稻幼苗叶绿素a含量比CK高20.2%，叶绿素b含量比对照高出30.2%，类胡萝卜素含量比对照高出14.8%。在HA改性SWCNTs暴露下，随着HA浓度的升高，水稻幼苗叶绿体色素含量呈增加的趋势，高浓度HA改性SWCNTs(R8)暴露下的水稻幼苗叶绿素a含量比对照高20.3%，叶绿素b含量比对照高出13.6%，类胡萝卜素含量比对照高出18.2%。

在原样SWCNTs暴露下，大豆幼苗3种叶绿体色素含量未呈现一致的变化趋势(见图8)。叶绿素a和类胡萝卜素含量随着浓度的升高，呈下降的趋势；而叶绿素b含量则呈上升的趋势。HA改性SWCNTs

图7 多壁碳纳米管暴露对水稻幼苗叶绿体色素含量的影响Ca：叶绿素a；Cb：叶绿素b；Cx.c：类胡萝卜素

图8 单壁碳纳米管暴露对水稻幼苗叶绿体色素含量的影响Ca：叶绿素a，Cb：叶绿素b，Cx.c：类胡萝卜素

暴露下，随着HA浓度的升高，叶绿素a与叶绿素b含量则呈上升的趋势，而类胡萝卜素含量的变化无规律性，而且3个处理无显著差异。HA改性SWCNTs的3个处理与原样处理(S4)相比，会明显提高叶绿素a和叶绿素b含量。

与对照相比，纳米TiO2与纳米ZnO暴露具有降低大豆幼苗叶绿素a含量的趋势，但并不显著(见图9)。纳米TiO2与纳米ZnO暴露对叶绿素a含量没有显著差异。结果表明，纳米TiO2与纳米ZnO暴露导致大豆幼苗叶绿素a的降解，而且纳米TiO2与纳米ZnO吸附HA后，并没有缓解这个趋势。与CK相比，纳米TiO2与纳米ZnO暴露明显降低了大豆幼苗叶绿素b含量；纳米TiO2比纳米ZnO对大豆幼苗叶绿素b含量的影响更为明显。纳米颗粒吸附HA后对纳米颗粒的毒性有缓解作用。图9显示，纳米颗粒暴露具有降低叶绿素(a、b)的趋势，引起叶绿素的降解。与CK相比，纳米TiO2与纳米ZnO暴露具有提高大豆幼苗类胡萝卜素含量的趋势，TiO2纳米颗粒比ZnO纳米颗粒的影响表现的尤为明显。纳米颗粒吸附HA后的表现有点复杂，纳米ZnO的作用比纳米TiO2的作用似乎相反，其影响机制缺乏规律性，有待于进一步研究。

图9 TiO2和ZnO纳米颗粒暴露对大豆幼苗叶绿体色素含量的影响(mg/g)Ca：叶绿素a，Cb：叶绿素b，Cx.c：类胡萝卜素

2.4 相关性分析

在MWCNTs及MHCNTs暴露下，脯氨酸含量具有随着MDA含量增加而增加的趋势，相关系数分别为r=0.494及r=0.702，相关不显著。在MCCNTs暴露下，脯氨酸含量具有随着MDA含量增加而降低的趋势，相关系数为r=-0.506，相关不显著。尽管相关不显著，但水稻幼苗在纳米胁迫下，具有抗性提高的趋势。在SW暴露下，水稻和大豆幼苗的脯氨酸含量与MDA含量相关不显著。

纳米TiO2暴露下大豆幼苗MDA与脯氨酸的相关系数r=0.793，相关不显著。纳米ZnO暴露下大豆幼苗MDA与脯氨酸的相关系数r=0.608，相关不显著。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。但是， 纳米TiO2比纳米ZnO暴露后脯氨酸含量反而有下降的趋势，可能与大豆本身对纳米颗粒胁迫的抵抗性有关。

3 讨 论

目前，大量研究表明纳米颗粒(NPs)对植物的毒性机制还很不确定[1]，主要致毒机制包括膜脂过氧化导致细胞膜完整性破坏、叶绿体及线粒体等细胞器损伤，氧化胁迫还会引起蛋白质和核酸变性基因毒性等[13]，这些致毒机制可能与NPs 的本身的表面理化特征有关。

本研究中，碳纳米管和金属氧化物纳米颗粒暴露均会导致作物幼苗MDA含量呈增加的趋势，表明纳米颗粒暴露会产生ROS，导致膜脂过氧化，对细胞造成一定程度的损伤。但是脯氨酸含量随着纳米颗粒种类及其剂量的变化并没有呈现明显的规律性，而且与MDA含量相关不显著，表明脯氨酸含量的增减可能与膜脂过氧化无关。植物体内抗氧化机制还需进一步研究。

4 结 论

随着碳纳米管浓度的增高，丙二醛(MDA)含量逐渐增高，且随之加入胡敏酸后丙二醛的含量明显减少。水稻幼苗在碳纳米管暴露下膜脂过氧化严重，因此对水稻幼苗有毒性效应。随着碳纳米管浓度的增加，水稻幼苗(MWCNTs及MHCNTs暴露下)和大豆幼苗(SWCNTs暴露下)脯氨酸浓度明显增加，呈上升趋势，表明其对纳米毒性具有的一定抵抗能力。多壁碳纳米管暴露下叶绿体色素含量呈降低的趋势，尤其是叶绿素a和叶绿素b可能发生降解。本研究证实了金属氧化物纳米颗粒暴露会引起膜脂过氧化，导致生物膜系统受损。纳米TiO2和纳米ZnO暴露下大豆幼苗内丙二醛(MDA)含量显著提高，表明纳米颗粒暴露导致膜脂过氧化，对植物造成严重伤害。纳米TiO2和纳米ZnO暴露具有导致叶绿素a、叶绿素b及脯氨酸含量下降的趋势。本研究还不足以阐明水稻与大豆幼苗对纳米胁迫的防御机制，需深入研究揭示植物对氧化胁迫的适应与防御机制。