王莲芝 张春蕾 张晶 李莹莹 江晖 郎临川 孙珺 崔岚巍 纪滨英

儿童结核病疫情严重，发病率、死亡率居高不下。2014年WHO[1]“Guidancefornationaltuberculosisprogrammesonthemanagementoftuberculosisinchildren”第2版出版，同时从战略上提出了“全球儿童结核病零死亡率”蓝图。但是由于儿童结核病症状不典型、取得病原学诊断依据困难等原因，常常导致延误诊断、延误治疗，“零死亡率”面临巨大的挑战。寻求简单、快速、灵敏的检测方法，快速诊断、精准治疗是儿童结核病防治亟需解决的关键问题。本研究应用荧光涂片显微镜检(简称“涂片检查”)、BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960法”)和GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)3种方法检测患儿晨起空腹胃液，探究GeneXpert检测胃液中结核分枝杆菌及其利福平耐药的效能，旨在为儿童肺结核的诊断和治疗提供有力的支持。

对象和方法

一、研究对象

搜集哈尔滨市胸科医院儿童结核科、哈尔滨市儿童医院呼吸科、哈尔滨医科大学附属第一医院儿科2017年9月至2018年12月收治的2个月至14周岁疑似肺结核患儿155例，平均年龄(6.8±1.6)岁，男88例，女67例。155例疑似肺结核患儿均为HIV检测阴性、未经抗结核药物治疗且资料完整者。最后临床诊断肺结核患者115例，非肺结核患者40例(包括细菌性肺炎21例，支原体肺炎14例，过敏性肺炎2例，肺隐球菌病1例，先天性肺囊肿2例)。

二、肺结核诊断与排除标准

1.肺结核诊断标准：儿童肺结核诊断标准参考《WS 288—2017 肺结核诊断》[2]，均为临床诊断。同时具备以下4条：(1)有呼吸系统症状、全身结核中毒症状或发育迟缓；(2)符合肺结核影像学特点；(3)结核菌素皮肤试验结果显示中度阳性或强阳性或γ干扰素释放试验阳性；(4)排除其他肺部疾病。

2.肺结核排除标准：(1)肺部病变经应用抗生素(非抗结核药物)治疗吸收；(2)结核菌素皮肤试验和γ干扰素释放试验均阴性。符合以上任一条即排除。

三、仪器和试剂

荧光显微镜BX41(购自日本奥林巴斯株式会社)，荧光染色液和抗酸染色液(购自珠海贝索生物技术有限公司)，全自动BACTEC MGIT 960液体培养系统、MGIT液体培养管和添加剂(购自美国BD公司)，GeneXpert 16模块扩增检测仪及MTB/RIF试剂盒(购自美国Cepheid公司)，MPB64蛋白抗原试剂盒(购自杭州创新生物检控技术有限公司)，罗氏药物敏感性试验(简称“药敏试验”)试剂盒(购自珠海贝索生物技术有限公司)。

四、实验方法

155例患儿全部于晨起空腹(禁食水4 h以上)抽取胃液至少2～3 ml，置于普通的样本瓶内，胃液收集后4 h内可直接送检，超过4 h需加入100 mg碳酸钠中和胃酸。本研究获得本院伦理委员会的批准，155例患者均签署知情同意书。

1.标本前处理：将送检的胃液放入50 ml螺口离心管中，3000×g离心15 min，弃上清，加入2.5 ml生理盐水混匀，取0.5 ml用于涂片检查，剩余2 ml分为2份，分别做MGIT 960和GeneXpert检测。

2.涂片检查：取0.5 ml前处理标本，于玻片正面右侧2/3处均匀涂抹成10 mm×20 mm的卵圆形膜，自然干燥。染色前加热固定。染色及镜检具体操作步骤和判读标准参见《结核病诊断实验室检验规程》[3]。

3.MGIT 960法：取1 ml前处理标本加入1 ml 4% 氢氧化钠混匀，静止15 min，加入磷酸缓冲液20 ml,3000×g离心15 min；弃上清，沉淀用0.5 ml磷酸缓冲液混匀后，全部加入有分枝杆菌培养营养添加剂的液体培养管中，混匀后放入BACTEC MGIT 960液体培养系统,仪器培养报阳后取培养后的菌液行萋-尼抗酸染色,确认是否为抗酸杆菌,然后行MTB菌种鉴定；经鉴定为MTB后，进行药敏试验。

4.GeneXpert法：采用美国 Cepheid公司生产的GeneXpert检测试剂盒及 GeneXpert全自动检测平台,严格按照操作规程对标本进行前处理后进行自动化检测及结果判定。

五、统计学处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计数资料以“率(%)”表示，两组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。以临床诊断为标准，评价GeneXpert法的检测效能；采用Kappa检验，分析GeneXpert法与MGIT 960法药敏试验的一致性，Kappa值>0.75为一致性较好，Kappa值<0.40为一致性较差，0.40

结 果

一、3种方法检测胃液中MTB的效能比较

以临床诊断为标准，涂片检查、MGIT 960法、GeneXpert检测胃液中MTB的敏感度分别为30.4%(35/115)、54.8%(63/115)、69.6%(80/115)，特异度分别为95.0%(38/40)、100.0%(40/40)、97.5%(39/40)，见表1。

二、GeneXpert对不同类型患者的检测效能

115例临床诊断为肺结核的患儿标本中，涂阳培阳30例，GeneXpert检测阳性29例，检出率为96.7%；涂阴培阳33例，GeneXpert检测阳性27例，检出率为81.8%；涂阴培阴47例，GeneXpert检测阳性19例，检出率为40.4%；涂阳培阴5例，GeneXpert检测阳性 5例。患儿为涂阳、涂阴、培阴时GeneXpert法检测的阳性率分别为97.1%(34/35)、57.5%(46/80)、46.2%(24/52)，以MGIT 960法为标准，GeneXpert法检测的敏感度为88.9%(56/63)。

表1 以临床诊断为标准3种方法的检测效能比较

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%

三、MTB利福平耐药性检测效能评价

115例临床诊断的肺结核患儿，MGIT 960法检测阳性63例，其中有56例GeneXpert检测也为阳性，7例GeneXpert检测阴性；56例两种方法检测均阳性的患儿中，MGIT 960药敏试验结果显示利福平耐药11例，利福平敏感45例。而GeneXpert检测利福平耐药13例，利福平敏感43例；有2例患儿MGIT 960药敏试验结果为敏感，而GeneXpert检测为耐药。以MGIT 960药敏试验结果为参考标准，GeneXpert检测MTB对利福平耐药的敏感度为100.0% (11/11)，特异度为 95.6%(43/45)，与MGIT 960药敏试验结果具有较好的一致性(Kappa值=0.894)。

讨 论

WHO[4]报告2017年儿童新发结核病患者101万例，占新发结核病患者例数的10%，死亡23.4万例；结核病患儿中耐多药结核病约占3.2%[1]，疫情较为严重。肺结核是儿童结核病的主要类型，约占70%～80%，由于临床症状不典型、排痰取痰困难、痰液载菌量低，且涂片检测的敏感度低、培养耗时较长，导致肺结核患儿早期获取病原学诊断十分困难。有文献报道，20%～47%培养阳性的结核病患儿在未治疗时已转院或失访[5]，这对疫情控制十分不利。

GeneXpert法是近年结核病领域的研究热点，是美国Cepheid开发的GeneXpert全自动一体化荧光定量PCR仪专用的MTB检测试剂盒，将样品的超声破碎、核酸提取、样品扩增、实时检测融于一体，能在2 h内直接检出标本中是否含有MTB及该菌是否对利福平耐药，其在成人肺结核中的诊断价值已得到部分研究证实[6-8]。虽然WHO已推荐GeneXpert法用于儿童结核病的诊断，但在不同标本中其检测结果差异较大，且缺乏大量有效的研究证实。儿童咳嗽反射弱，排痰量少，经常将呼吸道分泌物直接下咽；婴幼儿在入睡时，呼吸道的纤毛运动将含有MTB的痰液送至喉部，然后吞咽至胃内，在整个夜间会咽下大量呼吸道分泌物，而且夜间胃液分泌量明显减少，因此胃液被认为是较好的诊断儿童肺结核的标本类型[9]。检测胃液的敏感度高于诱导痰、支气管镜刷液、鼻咽吸取物和粪便标本[10-12]。Lu等[13]报道收集临床确诊的结核病患儿的痰液、胃液、支气管肺泡灌洗液(BALF)和脑脊液等标本进行检测，胃液的阳性率最高。即使是在涂阴肺结核患儿中，GeneXpert法检测胃液的敏感度也达到了48.6%[14]，充分肯定了肺结核患儿检测胃液的优势。

本研究以临床诊断为标准，应用涂片检查、MGIT 960法和GeneXpert法3种方法检测胃液中的MTB，GeneXpert法检测的敏感度为69.6%，特异度为97.5%，敏感度明显高于其他2种方法，这一结果与国内外的诸多报道一致[15-17]。国内张爱梅等[18]报道，对于临床诊断的结核病患儿中，GeneXpert检测各种标本总的敏感度和特异度分别为28.6%和87.5%；在肺外标本中，脓液穿刺液中的敏感度较高，接近100.0%，脑脊液和浆膜腔积液中检出率极低。本研究GeneXpert法检测胃液的敏感度介于上述结果之间，显著高于脑脊液和浆膜腔积液的检出率，高于Nicol等[19]报告的粪便检出率(33.3%)，也高于GeneXpert法检测痰液的敏感度(62%)[20]。可见，与传统的检测方法比较，GeneXpert法的诊断效能更高，且极大地缩短了检测时间，有助于儿童结核病的早期诊断；胃液检测具有良好的临床应用价值。

本研究患者为涂阳培阳时，GeneXpert检测的阳性检出率为96.7%，与张爱梅等[18]的研究结果(100%)一致，患者为涂阴培阳时GeneXpert检测的阳性检出率为81.8%，高于张爱梅等[18]的报道(33.3%)；GeneXpert在涂阳标本中的阳性检出率为97.1%(34/35)，与文献报道相近[21-22]；但在涂阴标本中阳性检出率仅为57.5%(46/80)，低于Li等[22]的报道，考虑与部分低龄儿童很难取到高质量、充足的胃液有关，多次、足量抽取胃液可能会提高检出率。在以培养为标准时，Scott等[23]与Chisti等[24]的研究中，GeneXpert检测的敏感度分别为59%和67%；本研究以MGIT 960法为标准，GeneXpert检测的敏感度为88.9%，高于上述结果，与最新的一项Meta分析中报道的结果一致(87%)[22]。对于MGIT 960法检测结果阴性的标本，GeneXpert法也有较高的检出率(46.2%)。

国外有文献报道，在将GeneXpert检测利福平耐药结果和表型药敏试验结果比较时，二者的一致性较高[25-26]。作为利福平耐药的快速检测，GeneXpert检测结果一般非常好，检测的敏感度、特异度分别为94%、98%[25]。本研究以MGIT 960药敏试验结果作为参考标准，GeneXpert法检测利福平耐药的敏感度为100.0%(11/11)，特异度为 95.6%(43/45)，与MGIT 960药敏试验结果具有较好的一致性(Kappa值=0.894)，与上述文献结果一致，也与国内韩丹等[15]的报道相符。有2例MGIT 960药敏试验结果显示敏感，而GeneXpert检测结果为耐药的患者，由于条件所限，没有进行基因测序验证。导致耐药性检测结果不一致的原因考虑有以下可能：(1)敏感菌和耐药菌混合生长时，GeneXpert检测更敏感，检测结果为耐药；(2)GeneXpert法对rpoB基因为哑基因时的菌株可能出现假阳性，而哑基因并不会改变其相应蛋白质的表达，造成与表型药敏试验结果不一致。

GeneXpert检测MTB敏感、快速,但也存在以下弊端：(1)由于其仅凭单一的靶基因扩增和检测单一的rpoB基因耐药决定区，可能导致产生一定的假阴性，本研究63例培阳标本中，有7例GeneXpert法检测阴性；(2)GeneXpert法检测野生型与突变型菌株混合标本的利福平耐药相关突变的能力有限[27]，且检测某些导致利福平耐药的rpoB基因C533G位点突变的能力也下降[28]；(3)检测患者混合感染时探针D和E产生的实时信号延迟，以及GeneXpert法会错误识别无法导致利福平耐药的rpoB基因F514F位点沉默突变，而F514F位点本身为利福平耐药的无功能突变[29]，导致GeneXpert检测偶尔会产生少量样本利福平耐药的假阳性报告[30-31]；(4)不能检测其他一线和二线抗结核药物，最新的一篇Meta分析报道，GeneXpert法在检测耐药性方面，新发耐利福平的患者中有33.3%表现出对异烟肼敏感，而之前已接受抗结核药物治疗的耐利福平患者中有14.8%对异烟肼敏感[32]；可见在检测利福平耐药的基础上，GeneXpert法并不能准确反应异烟肼耐药情况，因此对于耐药结核病发生率高的地区，不能作为MDR-TB调整治疗的依据；(5)GeneXpert 法是基于核酸扩增，检测结果阳性不一定存在活菌，也不能作为评判疗效的指标[33]；(6)GeneXpert 检测成本较高。

综上所述，GeneXper法检测过程简单、快捷，敏感度高、特异度强，其利福平耐药基因检测与MGIT 960药敏试验结果具有较好的一致性，对儿童肺结核的早期诊断及指导治疗具有良好的应用价值；但GeneXpert也存在一些弊端，在临床应用过程中仍需结合其他实验室方法进行综合分析，以提高确诊率和治愈率。