赵珏 孙娟 袁武锋 李丽洁

出生缺陷指胎儿出生前已经存在的结构或功能异常，其产生原因包括遗传、环境及两者共同作用。据统计，由遗传因素为主所致的出生缺陷占比约为20%～30%，由环境因素（如母体疾病、营养不良、感染、药物等）所致的出生缺陷占比约10%，剩余的出生缺陷多是遗传和环境共同作用的结果，故超过80%的出生缺陷与遗传因素直接或间接相关[1]。随着我国经济的快速发展，医疗卫生水平的不断提高，人们对优生优育日益重视，感染、药物使用不当、营养不良等导致的胎儿发育异常比例下降，而遗传因素引起的出生缺陷检出率升高[2]。染色体病是导致出生缺陷的最常见原因之一，约0.5%新生儿患有染色体病[3]。染色体病目前尚无有效的治疗方法，唯一可行的预防手段是及时进行产前诊断，防止严重的出生缺陷。故为了减轻患者、家庭及社会的经济和精神负担，应争取对有指征的孕妇行产前诊断，必要时及时终止妊娠。

细胞染色体核型分析是目前公认的产前诊断的“金标准”，羊膜腔穿刺术是现今产前诊断最常用且最安全的取材方法。本文回顾性分析有产前诊断指征，即高龄、血清学筛查异常、无创性产前检查（non-invasive prenatal testing，NIPT）高风险、超声检查异常、既往生育过缺陷儿、父母一方患有先天性或遗传性疾病或有遗传病家族史等的448例孕妇羊膜腔穿刺羊水细胞的染色体核型结果，以及根据不同穿刺指征选用的分子生物学技术，如染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）750K基因组芯片、基于微阵列的比较基因组杂交（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）及衍生技术 CGX 寡阵（CGX Oligo arrays）8×60K和细菌人工染色体微珠（bacterial artificial chromosome on beads BAC-on-Beads，BoBs）技术获得的结果，探讨羊水细胞染色体异常核型与产前诊断指征的关系，比较不同产前诊断指征的染色体异常检出率，以及不同的遗传学检测技术在临床的应用价值，为产前遗传咨询提供客观的实验数据和临床参考资料。

1 对象和方法

1.1 对象 2016年11月至2018年11月在我院产前诊断中心接受羊膜腔穿刺产前诊断的妊娠妇女共448例，年龄20～46岁，孕周17～26周。其中瘢痕子宫87例，年龄≥35岁的高龄孕妇163例。将高龄组按年龄分为3组，A组年龄≥35岁，但＜38岁，共57例；B组年龄≥38岁，但＜40岁，共45例；C组年龄≥40岁，共61例。对具有以下至少1项产前诊断指征的孕妇，在知情同意后行超声引导下羊膜腔穿刺术，行产前诊断。侵入性产前诊断的指征为：（1）妊娠年龄≥35岁；（2）孕妇血清学筛查高风险；（3）NIPT筛查高风险；（4）胎儿超声筛查异常：结构异常、可疑畸形、2个及以上软指标异常、颈项透明层（nuchal translucency，NT）厚度≥3mm等；（5）既往生育过缺陷婴儿；（6）父母一方患有先天性或遗传性疾病，或有遗传病家族史；（7）其他高度怀疑染色体异常的情况。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 签署相关知情同意书，完善术前检查后，所有孕妇接受B超引导下经腹羊膜腔穿刺术，抽取羊水25～30ml，其中20ml用于染色体核型分析，另5～10ml根据穿刺指征及患者的知情选择，选择产前BoBs、CGX 8×60k或CMA-750k等检测。

1.2.2 胎儿染色体核型分析 将20ml羊水分装至2支15ml离心管，1 200r/min离心后，弃去上清液，沉淀中加入广州白云山拜迪生物医药有限公司的羊水细胞培养基（批号：20160902-20180502）4ml/瓶，接种 2 瓶，5%CO2培养箱中37℃培养6d后观察细胞生长，有多个细胞集落生长即换液，每天观察，视细胞生长情况择机收获。以胰蛋白酶消化法制片，Giemsa染色后G显带，按人类细胞遗传学命名国际体系（ISCN，2005）描述异常核型。核型分析：每例取材需来自2个不同培养瓶，每瓶计数10～15个分裂相，采集3～5个核型图，嵌合体计数适当增加，计算异常细胞比例。

1.2.3 产前BoBs及CGX 8×60k检测 由苏州Perkin Elmer医学检验所完成，7～12个工作日出报告。

1.2.4 CMA-750k检测 由浙江博圣生物负责完成，15个工作日出报告。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计数资料以例数和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 羊膜腔穿刺结果分析 448份羊水细胞中，检出异常核型38例，检出率8.48%，以高龄为穿刺指征的163例，与其他穿刺指征比，受检人数占比最高，达36.38%，但异常核型检出率只有9.82%；以血清学筛查21-三体高风险为穿刺指征的127例，受检人数占比28.35%，异常核型检出率3.94%；以超声筛查异常为穿刺指征的78例，只占受检人数的17.41%，但异常核型检出率有11.54%，见表1。某些孕妇合并有多个羊膜腔穿刺指征，在统计归类时造成了一定困扰，为避免重复计数，将合并有多个产前诊断指征的归类到最常用（高龄）或风险值相对较高的穿刺指征（如超声筛查异常）组，高龄合并超声筛查异常的，若超声提示为结构异常或畸形，归为超声组，若仅为多个软指标异常，则归入高龄组。

表1 羊膜腔穿刺结果分析

2.2 胎儿染色体异常核型分析 448例孕妇羊膜腔穿刺均成功，无一例出现流产、羊水渗漏、感染等并发症而导致不良后果。羊水细胞培养成功率为99.78%（447/448），共检出异常核型38例，包括染色体数目异常24例、结构异常12例和2例多态变异；其中21-三体8例，占异常核型比例21.05%；18-三体6例，占15.79%，21-三体和18-三体中均有1例为嵌合体。异常核型对应的穿刺指征中高龄和超声筛查异常占比最高。因唐氏筛查21-三体高风险行产前诊断的发现核型异常5例，但其中核型确诊为21-三体的只有2例，其余3例分别为21号和13号染色体平衡易位，47，XXX和46，XN，dup（9）（q12），唐氏筛查 18-三体高风险也存在同样情况，见表2。

2.3 核型分析与分子生物技术检测结果分析 核型分析与分子生物技术检测结果分析见图1。核型或分子生物技术检测出异常的近三分之一伴有超声异常发现。15例染色体核型分析异常，但未被当时同步进行的BOBs或CGX检测所检出。5例臂间倒位，其中4例发生在9号染色体，且有 3 例为 46，XN，inv（9）（p11q13）；3 例臂内片段复制，也均出现在9号染色体，且有2例为46，XN，dup（9）（q12）；1 例罗氏易位；1 例平衡易位；1 例臂内倒位；1例低比例的三倍体嵌合体；1例46，XN，1qh+，1号染色体长臂异染色质区增加；1例47，XN，+mar；1 例 46，XN，22ps+，一条 22 号染色体随体偏大，B超提示消化道闭锁可能。另有1例因胎儿水肿伴颈部水囊瘤形成行羊水细胞核型+CGX检测，核型结果为46，X，+mar，分裂相少，CGX 检测结果为 45，X。1例因 21三体高风险行羊水穿刺，BoBs提示17p11.2区域缺失，为Smith-Magenis综合征，但核型提示正常。

2.4 不同遗传学检测方法检出率比较 所有的羊膜腔穿刺均行羊水细胞培养染色体核型分析，告知患者各遗传学检测方法检测范围及局限性，若单纯因高龄或血清学筛查高风险行产前诊断的一般选择同步行产前BoBs检测（患者选择CGX检测的例外）；合并有超声筛查异常的或合并有两个及以上产前诊断指征的，2017年均选择同步行CGX8×60k检测，2018年选择同步行CMA-750K检测。不同遗传学检测方法染色体异常检出率的差异无统计学意义（χ2=4.154，P=0.245），进一步两两比较，各方法间差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。2.5 高龄组不同年龄段染色体核型检测结果比较 高龄组不同年龄段间染色体异常检出率的差异无统计学意义（χ2=4.674，P=0.124）。进一步两两比较时，A 组染色体异常检出率低于C组，差异有统计学意义（χ2=3.927，P=0.049），其余各组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 4。

表2 胎儿染色体异常核型分析

图1 核型及分子生物技术检测异常数据统计

表3 多种遗传学检测方法检出率比较

3 讨论

染色体异常是目前仍无法治疗的先天性疾病，经过羊水细胞培养获得胎儿染色体核型的准确性可达99%[4]。高质量的羊水细胞培养及收获技术是进行羊水染色体分析诊断的关键[5]。本研究448例患者中，87例为瘢痕子宫，穿刺过程均顺利，无不良后果产生。某些学者对于瘢痕子宫是否能进行侵入性产前诊断持谨慎态度，根据本研究结果，认为瘢痕子宫并非羊膜腔穿刺禁忌证。羊水细胞培养成功率为99.78%，发现38例染色体异常，检出率为8.48%，高于相关文献报道结果1%～6.7%[6-7]。究其原因，可能与以下几方面相关：本研究将2例染色体多态性归结为染色体异常；羊膜腔穿刺指征的严格把关；随着2016年初“全面二孩”政策的开放，40岁以上孕妇进行羊水穿刺的比例增加。

表4 高龄组各年龄段异常核型检出率的比较

高龄妊娠是最早被提出的羊膜腔穿刺适应证。本研究中，高龄孕妇组胎儿异常核型的检出率为9.82%，高于国内外文献报道[8-9]，与近2年进行羊膜腔穿刺的40岁以上孕妇所占比例明显增多有关。众所周知孕妇年龄越高，发生胎儿染色体异常的风险越大。另外，本研究将合并多个羊膜腔穿刺指征，比如高龄合并超声软指标异常、高龄合并NIPT高风险等都归为了高龄组。近年国内专家对于单纯高龄孕妇（≥35岁）进行产前诊断存在异议，有专家推荐以NIPT来替代有创产前诊断[10]。但根据本研究结果，高龄孕妇的染色体异常不仅仅是非整倍体异常，常常涉及染色体结构异常，这是目前NIPT检测无法筛查的。有文献佐证，高龄孕妇随着年龄的增加，胎儿发生非筛查目标疾病的概率显著增加[11]。且本研究以高龄为单一穿刺指征发现的染色体异常核型9例，占发现的异常核型比例23.68%，故应重视高龄孕妇的产前咨询，并建议行产前诊断，以减少出生缺陷儿。但随高龄孕妇的增多，对于35岁以上的高龄孕妇，是否根据年龄分层，采用不同的产前诊断策略，以尽可能避免侵入性操作造成的不良结果，改善孕妇体验也是值得探讨的问题。加拿大和英国等国家将单胎妊娠直接羊膜腔穿刺的最低年龄提高至40岁[12]。国内有报道在高龄孕妇中，年龄38岁以上异常核型阳性率显著升高[13]。本研究将高龄孕妇根据年龄分为3组，统计结果发现，≥40岁的C组孕妇与≥35岁而＜38岁的A组异常核型检出率存在统计学差异，与≥38岁而＜40岁的B组无统计学差异。虽样本量少，但与国内文献报道结果基本一致。国内还有文献报道，同时采用孕中期血清学筛查可以将高龄孕妇羊膜腔穿刺率降低79.9%[14]。2007年美国妇产科医师学会（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）提出不论孕妇年龄大小均进行产前筛查；高龄孕妇通过产前筛查进行胎儿异常风险分层，可以大大减少不必要的有创产前诊断。这些研究为不同年龄的高龄妊娠采用不同的产前诊断策略提供了参考。

血清学筛查受到多因素影响，假阳性率较高，本研究统计结果21-三体高风险组异常核型检出率为3.94%，18-三体高风险组异常核型检出率为5.41%，血清学筛查高风险总的检出率为4.27%，均以血清学筛查高风险作为单一穿刺指征。NIPT是否可以取代产前血清学筛查也是近年的热点议题。加拿大妇产科协会（Society of Obstetricians and Gynaecologists of Canada，SOGC）以及ACOG专家意见指出：血清学的产前筛查不仅针对21、18-三体、开放性神经管畸形，同时还可筛查其它染色体异常，高风险孕妇的胎儿即使染色体正常，但不良妊娠结局风险增高[15-16]。从本研究显示，血清学筛查高风险通过产前诊断确认的7例染色体异常中非整倍体异常为4例，结构异常为3例，说明血清学筛查不仅仅局限于染色体非整倍体的筛查[17]，还可筛查其他异常，这是NIPT目前无法完全替代的。故本文认为血清学筛查高风险仍应作为独立的羊膜腔穿刺产前诊断指征。目前国内有些医院在孕妇知情选择下使用NIPT对血清学筛查高风险孕妇先行检测，再根据检测结果决定下一步检测方案。综上，此方法存在一定风险，需引起临床医师警惕。

针对超声提示异常胎儿，染色体核型分析可检出9%～19%的异常[18]，胎儿有结构畸形的染色体异常核型检出率常常更高[19]。作为穿刺指征，本研究将超声检查发现的胎儿结构畸形和软指标异常（2个及以上）均归为超声异常。本研究78例因胎儿超声检查异常而进行羊膜腔穿刺的患者中，检出染色体异常核型9例，染色体异常核型发生率达11.54%，与相关文献报道相符。孤立的超声软指标是否应作为侵入性产前诊断指征尚存在争议。本院选择根据该指标的严重程度结合病史、年龄、NT、早中期唐氏筛查结果、患者本人意愿等综合评估风险，有选择地进行侵入性产前诊断，尽量减少漏诊及价值不大的侵入性产前诊断。

分子遗传学诊断技术与染色体G显带分析技术相比，各有长短，可为互补。染色体核型分析在可及的分辨率内，可以发现所有染色体的数目与结构异常，获得的信息是全息的，但羊水细胞培养、染色体标本制备、核型分析等检测费时长、人力耗费大；此外，该技术不能检测单基因突变，也无法检测染色体微小片段增减导致的微缺失微重复综合征。荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）、BoBs等在内的快速产前诊断技术，提高了诊断的分辨率、缩短了检查时间，检测效率高，但只能对试剂盒设定的目标疾病进行检测，无法对染色体组的异常作全局分析。CMA技术能够在全基因组水平进行扫描，可检测染色体拷贝数变异（copy number variants，CNV），在检出染色体微小片段的缺失和重复中相比核型分析具有突出优势，但因为数据库的不同或完整性尚欠缺，临床意义不明的变异比例也较高，对临床医师解读报告和临床遗传咨询造成了一定的困扰。在本研究中CMA技术的异常检出率高于传统G显带分析技术，但其检出率的差异无统计学意义，可能与样本量较小及选用CMA时的穿刺指征不同等有关。

羊膜腔穿刺术是相对安全、稳定的，可被广泛应用于产前诊断的一门技术。应重视产前诊断中心的咨询工作，高龄孕妇及血清学筛查高风险都有进行产前诊断的必要性，尤其对伴有超声检查异常者，建议其行产前诊断；高龄孕妇可根据年龄进行风险再分层，采取不同的产前诊断策略，≥40岁的高龄孕妇不主张使用NIPT来替代产前诊断。胎儿染色体核型分析仍是金标准，但分子生物检测技术可作为产前诊断有力的补充。