谢伯剑 郑海红 甘梅富

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤[1]，过去几十年中全世界甲状腺癌的发病率急剧增加[2-3]，特别是在我国台州等沿海城市，每年有很多新发病例。这些新发病例大多数是甲状腺微小乳头状癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）[4-5]，即直径≤10mm 的甲状腺乳头状癌[6]。尽管PTMC的生物学行为往往趋向良性，患者病死率较低，但临床实践证明，仍有部分的PTMC会复发、转移甚至影响患者的生命[7]。V-RAF小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因突变是甲状腺乳头癌常见的基因变异形式，发生率可高达29%～88%[8-9]。研究证实，BRAFV600E的突变与PTMC的侵袭性有关，如甲状腺腺体外侵犯、淋巴结转移、肿瘤复发等[7,10-12]。本文就BRAFV600E基因突变和PTMC中央区淋巴结转移的相关性进行回顾性研究，探讨BRAFV600E基因突变是否能作为PTMC中央区淋巴结转移的危险预测因素[13]，为PTMC的精准外科干预提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2014年10月至2016年3月于我院行手术切除的PTMC患者的石蜡包埋标本200例用于本研究。所有患者均符合以下要求：（1）术前均通过超声诊断为单侧肿瘤；（2）术中和术后经病理学检查明确诊断为PTMC；（3）行单侧腺叶+峡部切除术和同侧中央区淋巴结清扫术；（4）常规检测肿瘤组织BRAFV600E基因突变情况。

1.2 Real-time PCR检测BRAFV600E突变 收集符合标准的石蜡标本，选择蜡块中间部分，行10μm切片，由病理科医师确认含肿瘤组织。以矿物油去除石蜡，离心裂解组织样本，向离心管水相中加入20μl蛋白酶K消化组织蛋白，孵育后向离心管加入RNase A去除RNA，使用 DNA提取试剂盒（Aide Biotechnology产品，批号：H215091801Y）提取DNA并进行测序。采用人BRAFV600E突变检测试剂盒（Aide Biotechnology产品，批号：P215101901X）检测BRAFV600E突变，严格按照使用说明书操作。阴性对照、阳性对照、内部质量控制等均按试剂盒说明书进行。待反应结束分析收集到的荧光信号，在阴性、阳性对照、内部质量控制均在合适范围的前提下，若待测基因循环阈值（Ct）＜28为BRAFV600E突变阳性，Ct≥28则为突变阴性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；相关性分析采用单因素和多因素logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTMC患者的临床病理资料 本研究共纳入患者男 38 例，女 162 例，年龄 21～70（44.5±10.0）岁；肿瘤直径 1～10（6.3±2.0）mm。患者的临床病理特征见表 1。

表1 PTMC患者的临床病理特征

2.2 BRAFV600E突变与临床病理特征的关系 BRAFV600E突变与PTMC患者临床病理特征的关系见表2。单因素和多因素分析显示，BRAFV600E突变与中央区淋巴结转移存在相关性（P＜0.05）。

表2 BRAFV600E突变与临床病理特征的关系

2.3 BRAF突变与中央区淋巴结转移的关系BRAFV600E突变阳性者存在中央区淋巴结转移的比例高于突变阴性者，差异有统计学意义（P＜0.05），而BRAFV600E突变阳性者中央区淋巴结切除数量以及转移数量与突变阴性者比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 3。

2.4 PTMC患者BRAFV600E突变相关因素的分层分析 为进一步了解BRAFV600E突变与中央区淋巴结转移的统计学关联，将患者按照肿瘤大小进行分组，在肿瘤大小不同的组内进行logistic回归分析，以探讨不同大小肿瘤中BRAFV600E突变和中央区淋巴结转移是否存在统计学关联。以肿瘤大小为分层标准进行单因素分析，结果见表4。进一步多因素分析显示，肿瘤大小≤5mm的患者中，合并桥本病与BRAFV600E突变相关（OR=2.362，95%CI:1.006～5.705，P=0.036）。肿瘤大小＞5mm 的患者中，中央区淋巴结转移与BRAFV600E突变相关（OR=0.817，95%CI:0.451～0.907，P=0.037）。

表3 BRAF突变与中央区淋巴结转移的关系

3 讨论

BRAF是一个原癌基因，位于7号染色体，能够编码一种丝氨酸/苏氨酸特异性激酶，BRAFV600E异常激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，是该信号通路中最为关键的激活因子。BRAF基因点突变的位置在CR3区15号外显子的1799位点。该位点发生T-A变化，导致密码子600位的缬氨酸（V）被谷氨酸（E）取代，即V600E突变。这一突变使维持BRAF基因失活的P环失效，导致BRAF基因活化[14]。激活的BRAF继续在MAPK信号转导通路发生影响，发生级联式激活反应，引起细胞的异常增殖和分化，最终导致肿瘤的形成。大量研究已经表明，BRAFV600E是PTC中最常见的遗传事件，发生率29%～88%[8-9]，揭示BRAF基因可能与甲状腺癌的分化增殖密切相关。本研究发现，PTMC患者中BRAFV600E的突变率为84.5%。同时有研究表明，在甲状腺良性病变中不存在BRAFV600E突变[15]，说明BRAFV600E突变可以作为预测甲状腺癌的分子指标，即如果术前发现有BRAFV600E突变，提示肿瘤为恶性的可能性大，需要行外科手术干预。

本研究进一步分析了BRAFV600E同中央区淋巴结转移的关系，发现中央区淋巴结转移与BRAFV600E突变之间存在相关性，BRAFV600E突变阳性者发生中央区淋巴结转移的比例高于突变阴性者，但是BRAFV600E突变阳性者中央区淋巴结清扫数量及转移数量与突变阴性者并无统计学差异。理论上肿瘤BRAF突变阳性，侵袭性增强，向中央区淋巴结转移的概率增大，转移淋巴结的数量也应增加，但本文并未得到这样的结果。笔者认为可能的原因有以下两方面：一方面本研究选择患者术后的标本进行BRAF突变检测，因此BRAF是否突变不会影响术中的清扫决策；另一方面可能与本研究样本量偏小有关。但BRAFV600E突变阳性者发生中央区淋巴结转移的比例更高，由此笔者认为BRAFV600E突变对中央区淋巴结转移具有一定预测价值，因此推断BRAFV600E基因突变状态可作为术前预测淋巴结转移的危险因素，该结果与 Sun等[9]和 Shi等[16]的研究一致。Fraser等[17]发现PTC中的BRAFV600E突变预示着淋巴结转移、甲状腺包膜外累及和无病生存率降低的风险增加。Zheng等[18]发现，BRAFV600E突变与临床病理结果不良密切相关，可能导致PTMC复发增加。即使是临床淋巴结阴性的PTC患者，包括PTMC患者，中央区淋巴结也容易发生隐匿性转移；而且随着肿瘤体积的增大，中央区淋巴结发生转移的概率也明显增加。本研究还发现BRAFV600E突变阳性且直径＞5mm的PTMC更易发生中央区淋巴结转移，预示该类型的肿瘤侵袭性更强，该结果与Wang等[19]及Vorasubin等[20]发表的研究结果一致，提示对于怀疑甲状腺癌的患者可以进行术前细针穿刺活检，并对活检组织进行BRAFV600E突变检测，有利于更加精确地判断肿瘤的良恶性。肿瘤直径＞5mm且BRAFV600E突变阳性的PTMC患者，出现转移和复发的概率更大，这可能与肿瘤体积增大，侵袭能力增加有关。肿瘤直径＞5mm且BRAFV600E突变阳性是相对高危的PTMC类型，需要进行更积极的外科手术干预[21-22]。手术时在有效保护喉返神经和甲状旁腺的情况下，应常规进行患侧中央区淋巴结清扫术，有利于进一步明确肿瘤分期，为PTMC的个体化治疗提供理论依据。对于肿瘤直径≤5mm的患者，本研究发现BRAFV600E突变状态与淋巴结转移无相关性，这可能是由于研究样本数量有限有关，最终结论可尚待扩大样本量后进一步验证。

表4 BRAFV600E突变以肿瘤大小不同分层的单因素分析

综上所述，本研究证实BRAFV600E突变、肿瘤大小有助于预测PTMC患者的中央区淋巴结转移情况。对于BRAFV600E突变阳性且肿瘤直径＞5mm的PTMC，手术过程中建议常规行中央区淋巴结清扫。本研究还存在以下不足之处：首先，本研究系回顾性分析，偏倚无法避免；其次，本研究所选的患者数量较少，时间跨度较短，缺乏有效的预后数据；最后，本文进行分析的临床参数项目有限，与中央区淋巴结转移有关的其他可能因素未被列出。