崔颖 陈继成 陈红艳

【摘要】目的：建立硫酸软骨素眼用膜剂的含量测定方法并对其进行质量研究。方法：优化间苯三酚显色法测定硫酸软骨素含量，并利用间苯三酚显色法测定眼用膜剂中硫酸软骨素含量;评价眼用膜剂的外观、性状、pH及重量差异;采用浆法评价其体外释药情况;利用Draize眼刺激实验的改良方法评价眼用膜剂的刺激性;并采用控制变量法考察其稳定性。结果：间苯三酚显色法最佳条件：浓盐酸浓度4mol/L，用量，显色剂用量，煮沸时间，检测波长，结果显示硫酸软骨素在范围内线性关系良好，精密度良好。测定硫酸软骨素眼用膜剂含药量为0474mg/片，无色透明、柔韧性良好、平整无泡、厚度适宜、pH70。平均重量为372mg;体外释放结果显示具有一定的缓释作用且无眼部刺激性;但眼用膜剂高温、高湿条件色泽变黄，含药量改变。结论：间苯三酚显色法可用于测定硫酸软骨素眼用膜剂含量;自制硫酸软骨素眼用膜剂外观，重量差异符合规定，无眼刺激性，pH符合眼用制剂标准;但对高温高湿不稳定。

【关键词】硫酸软骨素;眼用膜剂;间苯三酚法;含量测定;质量评价

【中图分类号】R25621

【文献标识码】A

【文章编号】2095-6851（2019）10-040-01

硫酸软骨素可用于治疗角膜炎、角膜溃疡、化学灼伤及热灼伤等角膜损伤。眼用膜剂的应用可解决普通的硫酸软骨素滴眼液的生物利用度较低的问题。本研究在前期实验的基础上进一步建立自制硫酸软骨素眼用膜剂的含量测定方法，并对眼用膜剂的质量进行考察。旨在为该类制剂的研究提供更好的理论基础及实验参考。

1 仪器与材料

集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）;超声波清洗器（深圳市洁盟超声波清洗机有限公司）;电热恒温鼓风干燥箱（巩义市英峪予华仪器厂）;T6紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）;BX1300综合药品稳定性試验箱（上海佐诚实验仪器有限公司）;RCZ-8B溶出试验仪（天津市精拓仪器科技有限公司）;硫酸软骨素（丰足生物有限公司）;聚乙烯醇17-88（天津市开发区乐泰化工有限公司）;间苯三酚（天津市光复精细化工研究所）;冰乙酸（天津市福晨化学试剂厂）;甘油（沈阳市华东试剂厂）;注射用水（实验室自制）;所有试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 硫酸软骨素眼用膜剂的制备

称取300gPVA17-88，用25ml注射用水浸泡24h，70℃恒温水浴使之溶解。加入甘油200g和硫酸软骨素150g，搅拌使形成均匀膜浆，将膜浆于70℃恒温超声脱气20min，将膜浆倾倒于经过预处理的玻璃板上，使膜浆在玻璃板上均匀铺展，并具有一定厚度。将玻璃板置于60℃烘箱中干燥1h，脱膜，在紫外灯下灭菌30 min。将膜剂切割成1cm*05cm的单剂量膜剂。

2.2 间苯三酚显色法的建立

硫酸软骨素为酸性粘多糖类物质，在酸性条件下加热水解，可断裂糖苷键，水解产物能够与间苯三酚反应而显粉红色，且溶液颜色与硫酸软骨素浓度在一定范围内符合Lambert-beer定律[1]。故选用该法进行含量测定。

2.2.1 溶液的配制

间苯三酚溶液的配制：称取250g间苯三酚，用95%乙醇溶液溶解并定容至50mL，得浓度为50mg/mL的间苯三酚乙醇溶液。置入冰箱冷藏待用。

显色剂的配制：分别吸取间苯三酚乙醇溶液1mL、冰醋酸3mL、4mol/L盐酸200mL，混匀即得，现用现配。

硫酸软骨素溶液的配制：精密称取0500g硫酸软骨素，纯化水溶解并定容至50mL，得浓度为10mg/mL的硫酸软骨素溶液。

空白辅料溶液的配制：取眼用膜剂处方中除主药以外的辅料，纯化水溶解并定容至50mL，即得。

2.2.2 检测波长的选择

分别吸取0mL、010mL、020mL、030mL、040mL硫酸软骨素溶液及空白辅料溶液04mL于10mL具塞试管中，分别加入300mL显色剂，用冰醋酸定容，置于100℃沸水中30min。再转移置冰水浴中5min，于400nm～800nm处扫描紫外光谱。结果硫酸软骨素水解液在400～800nm波长内有两处吸收峰，分别为44800nm、54450nm。54450nm处吸收峰随硫酸软骨素浓度的增大而增大，且空白辅料无干扰。故选择54450nm处作为检测波长。

2.2.3 盐酸浓度的考察

分别用浓度为2mol/L、4mol/L、6mol/L、8mol/L、10mol/L的盐酸溶液按显色剂配制操作，按222方法于54450nm处测定硫酸软骨素水解液的吸光度。结果吸光度变化不明显，当盐酸浓度为4mol/L时，吸光度较大，且干扰较小。故选择盐酸浓度为4mol/L。

2.2.4 盐酸用量的考察

分别吸取4mol/L盐酸溶液100mL、200mL、300mL、400mL、500mL配制显色剂，按222方法方法于54450nm处测定硫酸软骨素水解液的吸光度。结果水解液的吸光度随盐酸用量的增大而增大，但是杂质干扰也变大。盐酸用量为100mL时，处吸光度较大且杂质干扰较小。故配制显色剂的盐酸溶液的适宜用量为100mL。

2.2.5 显色剂用量的考察

根据最适盐酸浓度及用量配制显色剂，分别用100mL、300mL、500mL的显色剂对硫酸软骨素进行水解，按222方法于54450nm处测定硫酸软骨素水解液的吸光度。结果当显色剂用量为300mL时，吸光度最大，且杂质吸收较小。故显色剂的适宜用量为300mL。

2.2.6 沸水浴时间的考察

分别考察沸水浴时间15min、30min、45min、60min、90min、120min，按222方法于54450nm处测定硫酸软骨素水解液的吸光度。结果随着沸水浴时间的延长，吸光度无明显变化，而杂质干扰明显增大。沸水浴时间为30min时，吸光度较大且杂质干扰小。故选择沸水浴时间为30min。

2.2.7 标准曲线的绘制

分别吸取硫酸软骨素溶液010mL、020mL、030mL、040mL、050mL、060mL、070mL，按最佳水解条件测定硫酸软骨素水解液吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，进行直线回归，得回归方程为：y=04520x+01210（R2=09995），线性关系良好。

2.2.8 精密度

吸取硫酸软骨素溶液020mL，按按最佳水解条件测定硫酸软骨素水解液吸光度，每隔两小时测定一次，连续测定5次作为日内精密度;同法连续测定5天作为日间精密度。结果日内精密度良好，RSD<1%;日间精密度不佳，RSD接近5%，故本法應当天样品当天测定。

2.3 眼用膜剂的质量研究

2.3.1 性状、pH、重量差异及含药量测定

将21项下制得眼用膜剂按《中国药典》（2015版）第四部膜剂项下，考察膜剂的性状、重量差异[2]。另取10片，溶于05mL纯化水中，玻璃棒沾取少量溶液，润湿精密pH试纸，与标准比色卡对比，测其pH。按所建立间苯三酚显色法测定每片平均含药量。结果制得的眼用膜剂无色透明、柔韧性良好、平整无泡、厚度适宜。单片片重范围为316～428mg，超出重量差异限度的有一片，无超出限度一倍的膜片，符合药典规定;pH70。含药量为0474mg/片

2.3.2 释放度

按《中国药典》（2015版）释放度测定方法第三法小杯法，于第5min，15min，30min，2h，4h分别取样5mL，同时补充同等体积的释放介质，立即用微孔滤膜滤过，自取样至滤过应在30秒内完成[3]。吸取02mL澄清滤液按含量测定方法于5445nm处测定硫酸软骨素吸光度，计算浓度及累积释放度，绘制累积释放曲线。结果显示15min释放不足30%，至2h时接近完全释放。由此预测该眼用膜剂较滴眼剂能有效延长药物于眼部的作用时间。

2.3.3 刺激性

选用健康、无眼疾的家兔，采用左右侧自身对比的方法进行硫酸软骨素眼用膜剂的单次给药刺激性试验，左眼给药，右眼为空白对照。于给药后1h，2h，4h，6h，24h，48h，72h后至7天观察角膜、结膜、虹膜的受损状况即眼局部的情况。按照卫生部《新药（西药）临床前研究指导原则汇编》眼部刺激性试验反应评分表进行评分（该方法为Draize试验改良的试验方法）。在此评分系统中，对角膜受损的强度以及面积进行评分，为0～4分。对虹膜进行相关规定评分，为0～2分。对结膜发炎、水肿、分泌物打分，分别是0～3分，0～4分，和0～3分。刺激性严重程度以刺激性最大的家兔为准。按照评分标准得出的评分结果为2分，刺激性较低。

2.3.4 高温、高湿试验

取眼用膜剂150片置于表面皿上，开口，40℃温度下放置10天，于第五天和第十天取样，每次取样量为50片，考察其外观，含药量，pH，与第0天进行比较。取眼用膜剂150片于表面皿上，在25℃相对湿度75%条件下放置10天，于第五天和第十天取样，每次取样量为50片，按高温试验同法进行考察。结果显示高温条件下10天后样品色泽变为黄色，pH无明显变化，含药量增加;高湿条件下10天后样品色泽无明显变化，pH无明显变化，含药量增加。分析硫酸软骨素可能在高温、高湿条件下降解为在其最大吸收波长处有吸收的有关物质。

3 讨论

硫酸软骨素眼用膜剂在高温高湿均条件下均不稳定，可能分解为未知的有关物质，有关物质的具体成分还有待考察。故该眼用膜剂应该在阴凉干燥处保存，以免发生降解、变质影响治疗效果。由于该膜剂为眼用制剂，所以对它的刺激性评价尤为关键，在厚度、柔韧性等方面也有着严格要求，避免对眼部造成刺激。膜剂的性状评价无准确标准，会因实验人员的不同而产生较大差异，评价结果有着很强的主观因素，会随着评分人员的不同而产生变化。由于制备者的不同，或者批次的不同对其含量，厚度等方面都会产生影响，因此其质量不可控因素较多。

参考文献：

[1] 张华珺，陈敏，李慧，等. 硫酸软骨素间苯三酚光度分析法的改进研究[J]. 食品研究与开发，2006， 27（7）： 163-168

[2] 连晓佳，多种换孢菌素A眼用制剂稳定性， 结膜刺激性IL-6水平影响的研究[D]. 天津： 天津医科大学， 2014： 6-7

[3] 李沙，李晓飞，刘娟，等.紫草膜剂的制备及左旋紫草素的含量测定[J]， 中国医院药学杂志， 2011， 31（12）：962-963