田 丽，时邵辉，胡虹宇，陈胜男，李松美，王春生

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

Oct4是POU(Pit-Oct-Unc)结构域的转录因子家族中的一员，由Pou5f1基因编码[1,2]。它一般通过与保守序列的八个碱基“ATGCAAAT”结合，参与调控下游的基因。Oct4作为多能性基因是最早被发现的，主要在受精卵、桑椹胚(morula)、卵裂球、囊胚内细胞团以及着床后胚胎的上胚层(epiblast)和原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)等多能性细胞中表达[3]。例如在小鼠中，将Oct4基因敲除，该胚囊正常植入后不能形成多能性的内细胞团，因此不能正常着床而停滞发育，在着床前期囊胚阶段（胚胎发育3.5～4.5 d）死亡。表明Oct4基因在早期胚胎发育过程中形成多能性细胞是必要的[4]。同时研究表明，在体外培养的ES细胞中Oct4基因受到精确调控，只有当Oct4在一定范围内表达，细胞可保持未分化状态。当Oct4表达量比两倍正常水平还要高时，可导致ES细胞向原始内胚层(primitive endoderm)和中胚层分化；当表达量低于正常水平50%时，ES细胞将会向滋养层（trophectoderm）和原始内胚层分化[5]。但在去除外源性抑制因子的情况下，即使有Oct4基因，ES细胞也会呈现出分化状态，这说明Oct4不是维持ES细胞亚全能分化特性的唯一条件，同时也证明了Oct4在ES细胞中的表达确实经过精确调控，其表达水平决定了ES细胞的命运[6]。Oct4基因不仅在ES细胞培养中发挥重要作用，还是用于产生iPS细胞的大多数转录因子混合物中必需的中心重编程因子[7]。

目前，已经克隆了人[8]、猪[9-11]、牛[12]和小鼠[13]等物种的Oct4基因，与其他动物相比，关于绵羊Oct4基因的相关报道很少。在本研究中，从体外发育的囊胚中扩增出绵羊Oct4基因编码区序列，在此基础上，预测了绵羊Oct4所表达的蛋白质结构，并与其他物种进行了比较，为进一步研究绵羊Oct4基因的功能及利用绵羊源因子诱导绵羊体细胞重编程研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、载体和菌株

rTaq DNA聚合酶、T4连接酶、Oligo15引物、iPrep Trizol Plus RNA试剂盒（Invitrogen)、反转录试剂盒（TAKARA）、质粒小提小量试剂盒（BioTeke）、胶回收试剂盒（Omega）；pMD18-T 载体；Trans5α 感受态细胞（TransGen Biotech）。

1.2 绵羊囊胚总RNA的提取

按iPrep Trizol Plus RNA试剂盒的说明书提绵羊囊胚总RNA，置于-80℃冰箱保存。

1.3 总cDNA的获得

将上述总 RNA 1μg、Oligo15（50uM）1 μL加入 0.2 mL微量离心管中，用 RNase-free H2O 补齐至10 μL，70 ℃水浴 10 min，2 min 冰浴，然后依次添加 5×M-MLV Buffer 2 μL、dNTP（10mM）0.5 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、RTase M-MLV 5 μL 和 RNase-free H2O 0.75 μL，42 ℃水浴 1 h，70 ℃保温 15 min，冰浴几分钟，获得总cDNA，-20℃条件下保存，用于扩增绵羊Oct4基因。

1.4 引物设计

根据GenBank中牛Oct4基因的CDS部分，与绵羊基因组作对比，得到5个同源序列片段，连接片段，和牛Oct4基因的CDS同源性为97.78%，对应氨基酸序列同源性为98.33%，推测该序列为绵羊Oct4基因的CDS区，设计该基因上下游引物，并分别引入适当的酶切位点。引物由大连TaKaRa公司合成，引物 相 关 信 息 如 下 ：Oct4-1 5’： GGGAATTATGGCGGGACACCTCGCTTC3’； Oct4-2 5’：GGGCTCGTCAGTTTGAATGCATAGGA 3’。

1.5 Oct4基因的扩增

基于上述实验所得到的cDNA模板，Oct4-1和Oct4-2作为引物，PCR扩增Oct4基因。PCR反应体系（总 25 μL）：cDNA 1μL，dNTP（2.5 mM）4μL，rTaq Buffer（10x）2.5 μL，上下游引物各 1 μL，rTaq 酶 0.3 μL。PCR 反应条件：94°C预变性 5min；94°C变性 30 S，58°C退火 45 S，72℃延伸90 s，共 30个循环，循环结束后72℃延伸7min。

胶回收PCR产物。室温条件下，与pMD18-T simple载体连接10 min，用5μL连接产物转化50 μL Trans5α型感受态细胞，涂平板，用Amp抗性及蓝白斑一起进行筛选，挑取白色克隆菌株于含有Amp的LB培养基中，置于摇床中震荡培养，扩大克隆菌株，质粒小提小量试剂盒提取质粒。

将重组质粒用限制性内切酶BamHI和HindII双酶切，通过酶切鉴定连接正确的Oct4-pMD18重组质粒，并送Invitrogen公司测序。

1.6 生物信息学分析

分别使用NCBI blastn程序和DNAMAN软件比对核苷酸序列和推导的氨基酸序列，并利用NCBI网站上的ORF finder分析软件对开放阅读框(ORF)进行识别。使用DNAMAN5.2软件对高同源蛋白的氨基酸序列进行比对，构建了系统进化树。使用PlantsP(http：//plantsp.genomics.purdue.edu/html/)和ScanProsite软件(http：//us.expasy.org/prosite/)对蛋白质功能结构域进行分析。使用Psort软件(http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/)定位Oct4蛋白的亚细胞。

2 结 果

2.1 PCR扩增绵羊Oct4基因

Oct4-1和Oct4-2作为扩增引物，RT-PCR扩增获得的模板cDNA，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，紫外灯照射下可见凝胶上呈现出约1 100 bp的目的条带（图1-3）。

图1 Oct4基因PCR扩增

图2 pMD18-T simple-Oct4质粒PCR鉴定结果

图3 pMD18-T simple-Oct4质粒双酶切鉴定结果

2.2 绵羊Oct4编码区核苷酸序列及氨基酸序列分析

生物软件分析测序正确的Oct4-pMD18重组质粒，分析表明绵羊Oct4基因编码区序列长度为1 083 bp包括终止密码子在内，可以编码360个氨基酸。绵羊Oct4基因CDS区的核苷酸序列相比与牛、猫、人、恒河猴、小鼠、兔、大鼠和猪等物种，相应序列的同源性分别为97.8%、91.1%、89.1%、89.0%、82.3%、85.7%、83.2和94.7（图 4），其氨基酸序列同源性分别为 98.3%、93.1%、91.4%、91.1%、83.8%、85.7%和 97.2（图 5）。

图4 绵羊Oct4基因CDS序列与其他物种同源性分析

图5 绵羊Oct4蛋白氨基酸序列与其他物种同源性分析

利用DNAMAN软件获得了九种动物Oct4基因氨基酸序列的系统进化树。结果表明，与绵羊亲缘关系最接近的是牛，具有很小的遗传距离；与猪、猫、兔、人、恒河猴、小鼠及大鼠亲缘关系依次变远，基本上与传统分类学保持一致（图6）。

图6 九个物种Oct4基因编码区核苷酸序列构建的系统进化树

2.3 分析绵羊Oct4蛋白三维结构

利用在线软件（http：//prosite.expasy.org/）对绵羊Oct4基因进行分析，分析表明在156-168位氨基酸（KRItLGYtQaDVG）和180-193位氨基酸（SQTTICRFEaLqLS）含有两个 POU结构域特异性结构（如图7），在263-286位氨基酸含有1个HOMEOBOX-1结构域（IAqqLgLEkdVVRVWFcNrrqkgK）。

图7 绵羊Oct4蛋白质的三维结构

3 结论与讨论

Oct-4是动物种系之间具有高度保守性的POU转录因子，也是迄今发现最早也是最重要的维持胚胎干细胞多潜能性和促进自我更新的关键因子[14,15]。它的表达水平不仅决定了ES细胞的命运，影响其分化状态，还在诱导小鼠成纤维细胞成为多功能干细胞过程中发挥重要作用[16-18]。猪和牛等家畜的Oct4基因已经被克隆，分子特性也已被阐明[9-12,19]。但迄今为止，尚未见到有关绵羊Oct4基因的相关报道。由于Oct4基因具有强组织表达特异性，仅表达与胚胎干细胞和原始生殖细胞等具有多潜能性的细胞中，随细胞的分化表达量下降，体细胞中未见表达，所以Oct4基因的克隆十分困难。Bao L等[20]也曾尝试利用小鼠的这四个因子诱导绵羊体细胞重编程，结果表明诱导效率较低，被诱导的细胞不能启动内源多能性基因的表达。研究组推测各因子氨基酸同源性的不同导致蛋白质空间结构更大的差异是造成异源因子诱导效率低的重要原因之一。因此，为克隆获得绵羊的Oct4基因序列，本研究利用牛Oct4基因的CDS序列与GenBank的绵羊基因组比对，发现5个同源结构域，推测为绵羊Oct4基因的5个外显子，并将该5个外显子拼接，序列包含1083个碱基，为3的整数倍，且包含终止密码子“TGA”。针对该序列设计引物，从绵羊囊胚的cDNA中扩增获得一段基因序列（见图1-3），该序列与牛CDS的同源性高达97.8%，与其他物种Oct4基因具有82.3%以上的同源性，具有较高的同源性（见图4）。与此同时，推测的氨基酸序列与牛的同源性高达98.3%（见图5）。对本研究中获得的Oct4基因的编码序列分析显示，Oct4定位于细胞核中（图7）并含有符合Pou box氨基酸的统一序列。这些结果说明，Oct4调控绵羊细胞分化过程的机制可能与其他动物相同。

综上所述，本研究通过整理和合成成功获得了绵羊的Oct4基因，但该基因是否可用于提高绵羊iPS的诱导效率需要进一步研究验证。