周春娜，陈 磊，卞艳芳，李 玲

(1.海军军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.海军军医大学药学院分析测试中心，上海 200433)

墨旱莲为菊科一年生草本植物鳢肠(EcliptaprostrataL.)的全草[1]，其味甘、酸，性寒，归肾、肝经，具有滋补肝肾，凉血止血之功，主产浙江、广东、湖北、广西等地，其主要成分包括三萜类、香豆草醚类、黄酮类、甾体类、噻吩类和挥发油等物质，具有很强的免疫调节、保肝、抗纤维化、抗肿瘤、抗氧化等药理作用[2]。植物代谢组学从宏观角度研究植物的生理生化过程，研究植物在特定条件下的代谢表型以及这些表型与基因型之间的联系。采用高通量检测和数据处理对植物中低分子量物质进行定性和定量分析，可以更科学、全面地反映中药化学成分由于品种、生长环境和炮制方法等因素的影响而发生的变化，为中药现代化的深入研究提供了新的技术手段[3]。目前代谢组学的研究方法主要有GC-MS法、核磁共振技术(NMR)、LC-MS法等。其中，基于GC-MS法的代谢分析平台具有高灵敏度、高分离能力以及商品化的代谢物标准谱图库等优势，已广泛地应用于植物代谢组学研究中[4]。如用GC-MS法对拟南芥、玉米、水稻等植物的代谢产物进行分析，为植物的代谢多样性研究提供了参考依据[5,6]。本研究以墨旱莲为研究对象，开展了基于衍生化GC-MS法的植物代谢轮廓分析，利用质谱数据库进行定性鉴别，并采用主成分分析(principal component analysis，PCA)对数据进行模式识别，为墨旱莲代谢组学的进一步研究提供依据。

1 材 料

1.1 仪器 Thermo Trace GC Ultra & DSQII气相色谱-质谱联用仪、FRESCO台式冷冻离心机(美国赛默飞世尔公司)；METTLER AE 240型电子天平(瑞士梅特勒公司，精度：0.1 mg)；LX-02药材粉碎机(上海利祥公司)；DZG-6020真空干燥箱(上海益恒实验仪器公司)。METLAB软件(美国MathWords公司)；SIMCA-P V11.0软件(瑞典Umetrics公司)。

1.2 试药 甲氧基胺盐酸盐(methoxyamine hydrochioride)、吡啶(pyridine)、N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、核糖醇(ribitol)购自Sigma Aldrich公司；甲醇(色谱纯，德国默克公司)；氯仿、正庚烷(分析纯，上海国药试剂公司)；水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团)。

墨旱莲分别采自3个不同产地和4个不同时间，见表1。由海军军医大学药学院贾敏副教授鉴定为墨旱莲。实验从不同产地和不同采收时间两个层面进行墨旱莲代谢轮廓分析，每组分别取6 个单独的植株作为重复，于-80 ℃冰箱保存。

表1 墨旱莲的采收时间、产地及分组Table 1 Harvest time,origins and grouping of Ecliptae Herba

2 方 法

2.1 样品的提取 取保存在-80 ℃冰箱中的墨旱莲，置于研钵中，液氮冷冻下充分研磨后，精密称取50.0 mg，置于2 ml离心管中，加入浓度为0.2 mg/ml的内标核糖醇水溶液50 μl(精密称取核糖醇对照品10.0 mg，溶于50 ml纯净水中)及1.5 ml提取溶剂(甲醇∶氯仿∶水=3∶1∶1)，超声提取20 min，随后于4 ℃下1.68×104×g离心5 min，取上清液1 ml，加纯净水500 μl，涡旋混合10 s，1.5×103×g离心5 min，取上层水相500 μl，冷冻干燥，备用。每组取等量的上清液混合，作为质控样品(QC)。

2.2 样品的衍生化 冷冻干燥后的样品中加入浓度为15 mg/ml的甲氧胺吡啶溶液50 μl(精密称取甲氧基胺盐酸盐30.0 mg，溶于2 ml吡啶中)，涡旋30 s，于30 ℃振荡反应90 min，加入100 μl MSTFA(含1%的TMCS)，涡旋30 s， 37 ℃振荡反应30 min，再加入200 μl正庚烷，涡旋30 s，1.5×103×g离心5 min，取上清液100 μl至进样小瓶。

2.3 色谱和质谱条件 采用Agilent DB-5MS UI 气相色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，分流比10∶1，进样口温度260 ℃，程序升温：起始温度70 ℃，以5 ℃/min的速率升温至160 ℃，然后以3 ℃/min升至220 ℃并保持2 min，再以10 ℃/min 的速率升至300 ℃，并保持10 min，传输线温度260 ℃，载气为高纯氦气，流速1 ml/min，进样量1 μl。质谱采用电子轰击离子源，温度为200 ℃，电子能量70 eV，扫描范围(m/z)：40～600，溶剂延迟时间：4 min。

2.4 稳定性考察 由于植物代谢物的成分复杂，为确保实验过程中系统的稳定性，用QC样品进行监测，以保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)来表示。本研究中采用了三阶段的程序升温，在每一个升温阶段随机选取了3个色谱峰的提取离子进行系统稳定性考察，色谱峰保留时间的RSD为0.003%～0.088%，峰面积的RSD为2.06%～7.97%，结果表明系统稳定，该方法适合于后续样品的分析。

2.5 样品测定 在优化的GC-MS条件下，对不同产地和不同采收时间的墨旱莲样品进行测定，得到的总离子流图见图1。所得的数据经NIST数据库比对，去硅烷基，还原化合物中的活泼氢，进行定性分析，结果鉴别了38 种化合物(见表2)，其中包括18种有机酸类、3种氨基酸类、8种糖类、8种醇类、1种其他类成分。

图1 墨旱莲初级代谢产物的GC-MS总离子流谱图Figure 1 GC-MS total ion chromatogram of primary metabolites of Ecliptae Herba

2.6 数据处理 将原始数据经Xcalibur File converter工具转换为通用的CDF格式，转换后的数据进一步通过R软件、XCMS程序包进行峰校正和积分，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的三维数据矩阵，然后用METLAB软件进行中心化和归一化。将数据导入SIMCA-P V11.0软件进行PCA，根据相关R2、Q2值对模型进行评价。采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，比较多组间平均值的统计学差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

表2 墨旱莲代谢产物的GC-MS定性分析结果Table 2 Analysis results of metabolites of Ecliptae Herba by GC-MS method

2.7 PCA 墨旱莲的极性代谢产物GC-MS总离子流图经Xcalibur File converter格式转换，通过XCMS提取校正，为了简化数据矩阵，对保留时间相同(保留两位小数)的离子进行无靶标的筛选(即在同一保留时间下，只保留峰强度最大的离子)，最终得到189个离子。将处理后的数据导入SIMCA-P V11.0软件，采用无监督的PCA法，呈现数据的自然分布特征，结果见图2。

图2 墨旱莲极性代谢产物主成分分析得分图Figure 2 Score plot of polarity metabolites of Ecliptae Herba analyzed by principal component analysisa:于2016年9月采自湖南长沙；b:于2016年9月采自湖北襄樊；c:于2016年8月采自广西桂林；d:于2016年9月采自广西桂林；e:于2016年10月采自广西桂林；f:于2016年11月采自广西桂林

2.8 不同产地的墨旱莲代谢物分析 对相同采收时间不同产地的墨旱莲代谢产物进行分析，结果见图3 A。3组样本得到了明显的区分，而且所建立的模型R2X、R2Y、Q2分别为0.944、0.946、0.930，表明模型具有良好的预测能力和可靠性。根据主成分载荷因子可知何种代谢物对分类贡献最大，见图4A。载荷图上每个点代表一个变量，离原点距离越远，表明该成分含量变化对分组的贡献越大。通过合并来自同一化合物的变量，最终得到8个具有分组意义的变量，分别是琥珀酸、丙三醇、苹果酸、L-脯氨酸、4,6-二羟基-2-巯基嘧啶、葡萄糖、肌醇、十八烷酸，其相对含量见图5。

图3 不同产地和不同采收时间的墨旱莲代谢产物的主成分分析得分图Figure 3 Score plot of metabolites of Ecliptae Herba analyzed by principal component analysis based on different origins and different harvest timeA:不同产地的墨旱莲(a采自湖南长沙，b采自湖北襄樊，d采自广西桂林)；B：不同采收时间的墨旱莲(c于2016年8月采收，d于2016年9月采收，e于2016年10月采收，f于2016年11月采收)

图4 不同产地和不同采收时间的墨旱莲代谢物的主成分分析载荷图Figure 4 Loading plot of metabolites of Ecliptae Herba analyzed by principal components analysis based on different origins and different harvest timeA:不同产地的墨旱莲；B：不同采收时间的墨旱莲

图5 不同产地墨旱莲差异代谢物的相对含量Figure 5 Relative contents of differential metabolites of Ecliptae Herba harvested from different origins

图6 不同采收时间墨旱莲差异代谢物的相对含量Figure 6 Relative contents of differential metabolites of Ecliptae Herba harvested at different time

3 讨 论

植物代谢组学是代谢组学研究的重要组成部分。GC-MS法是植物代谢组学研究中常用的分析技术，前处理是其中的关键步骤，是获得可靠数据的前提。甲醇-氯仿-水体系是常用的提取液。作者前期考察了不同溶剂比例的提取液提取到的代谢物的数量和相对峰强度，发现甲醇-氯仿-水的体积比为3∶1∶1时，提取到的代谢物数量最多，峰强度合理，因此，选择该比例的提取液作为提取溶剂。代谢组学常用的衍生化试剂包括双(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(BSTFA)和MSTFA，两者效果相似，但MSTFA沸点较低，对代谢物分析影响小，因此选择MSTFA作为硅烷化试剂。

本研究基于GC-MS法对不同产地和不同采收时间的墨旱莲药材的代谢产物进行分析，分别探讨产地和采收时间对代谢物的影响，发现区分产地和采收时间的差异代谢物不尽相同。对比Fiehn[7]对拟南芥代谢组学的研究，在拟南芥分类中起着重要作用的物质，如苹果酸、葡萄糖、果糖等在本研究中也显示为主要的差异代谢物，而这些代谢产物是否可直接用于墨旱莲产地或采收时间的区分有待进一步研究。

墨旱莲喜生于湿润之地，耐阴性强，能在阴湿地上生长良好，不耐干旱，在稍干旱之地，植株矮小，生长不良，因此生长地的气候环境对植株的生长很重要。湖南和湖北四季分明，全年雨量充沛，但在7～8月常有伏旱，而广西桂林地处低纬，属中亚热带季风气候，气候温和，雨量充沛，光照充足，夏长冬短，雨热基本同季。产地为广西桂林的墨旱莲代谢物在第一主成分上与产自湖北襄樊和湖南长沙的分离趋势更为明显，因此，气候条件可能是造成墨旱莲代谢产物存在差异的原因之一[8]。肌醇是植物生长和发育的必要条件，在植物体内作为重要的前体和原料，参与细胞壁和细胞膜的生成、营养储存、信号传导、逆境调节等多种生命活动，发挥着重要的生理作用[9]。脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，并以游离状态广泛存在于植物体中。植物在受到不同环境胁迫时，其体内常伴有游离脯氨酸的积累，这可能与逆境水平及植物对这种逆境的抗性有关[10]。本研究中肌醇和脯氨酸被筛选为不同产地的墨旱莲的差异代谢物，可能与植物的抗逆胁迫有关。

中药的化学成分是药材植株在生长发育过程中的代谢产物，在不同生长发育阶段，代谢产物的累积不同，因此不同采收时间对药材代谢产物的数量和含量具有较大影响。与9月份和10月份采收的样品相比，8月份采集的墨旱莲样品大部分代谢产物含量偏低，11月份采集的样品含量较高。墨旱莲的花期为7～9月，果期为9～10月，一般在果实近成熟时采收。本研究中8月份采集的样品为幼果期，可能是该组药材大部分代谢产物含量偏低的主要原因。初级代谢是次级代谢的基础，可以为次级代谢产物合成提供前体物和所需要的能量；次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续与发展，这些差异的初级代谢产物对于药材的次级代谢产物含量的影响，有待进一步研究。