陈肖珍，张 莹

(广东省深圳市光明新区人民医院药剂科，广东深圳 518106)

山药(Rhizomadioscoreae)是薯蓣科薯蓣属植物薯蓣(DioscoreaoppositeThunb.)的根茎，其味甘、性平，具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精等功效，属于药食同源之上品[1]，具有营养价值、药用价值和经济价值均高的优点。研究发现，山药含有蛋白质、氨基酸、多糖、尿囊素、皂苷等活性成分。由于皮肤中的多糖广泛参与细胞活动而产生多种生物学功能，如增强免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗辐射和延缓衰老等[2]。本文研究了山药多糖的吸湿、保湿性能及体外透皮吸收特性，为其相关的功能性产品开发及应用提供实验依据。

1 材 料

1.1 仪器 Shimadzu UV-2700型紫外分光光度计[岛津企业管理(中国)有限公司]；YB-P6智能透皮实验仪(天津药典标准仪器厂)；DL-720E超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；UPH-Ⅰ超纯水机(成都超纯科技有限公司)；BS-224S型分析天平(德国Sartorius公司)；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 药品和试剂 怀山药(批号180110，广州至信中药饮片有限公司)；D-无水葡萄糖对照品(批号110833-201506，中国食品药品检定研究院)；海藻酸钠(中国医药集团上海化学试剂公司)；甘油(天津市津东天正精细化学试剂厂)；微粉硅胶(安徽山河药用辅料股份有限公司)；其他试剂均为分析纯；水为超纯水(广东省深圳市光明新区人民医院自制)。

1.3 动物 SD大鼠，体质量(200±10) g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号:SYXK(粤)2017-0125。

2 方法和结果

2.1 山药多糖的制备[3]将怀山药烘干、粉碎，过60目筛，称取100 g，用5倍量的95%乙醇加热回流提取3次，每次1.5 h，去掉上清液，收集滤渣。滤渣加入水，100 ℃加热提取3次，每次2 h，将提取液离心(相对离心力2.26×103×g)，取上清液浓缩至1 g生药/ml，加入95%乙醇沉淀，在4 ℃冰箱静置12 h，离心(相对离心力1.37×103×g)，沉淀依次用95%乙醇、丙酮、乙醚各100 ml搅拌、抽滤，将沉淀冷冻干燥，得到山药多糖。

2.2 吸湿性实验[4，5]将山药多糖、甘油和海藻酸钠烘干至恒重，室温下分别准确称取0.5 g，每个样品做3份平行操作，置直径3 cm的培养皿中，将培养皿分别置3个干燥器中，温度(23±1) ℃，干燥器内分别放有已放置6 h的饱和乙酸钾溶液(相对湿度43%)和饱和硫酸铵溶液(相对湿度81%)，放置1、2、4、6、8、12、16、24、36、48 h，分别称量样品放置前质量(w0)和放置后质量(wm)。按以下公式计算吸湿率：吸湿率= [(wm-w0)/w0]×100%。

2.2.1 在相对湿度43%环境中的吸湿率 山药多糖、甘油和海藻酸钠在相对湿度43%环境中的吸湿率见图1A。由图1A可见，在0～2 h内，山药多糖与海藻酸钠的吸湿率基本一致，2 h后增速变化明显；在0～48 h内的吸湿率，甘油>山药多糖>海藻酸钠，甘油的吸湿率比山药多糖和海藻酸钠都上升更快，而山药多糖的吸湿率比海藻酸钠上升更快。

2.2.2 在相对湿度81%环境中的吸湿率 山药多糖、甘油和海藻酸钠在相对湿度81%环境中的吸湿率见图1B。由图1B可见，在1～4 h内，海藻酸钠和山药多糖的吸湿率表现出较一致的匀速上升趋势，4 h后山药多糖则上升更为明显。0～48 h内的吸湿率由大到小排列依次是甘油、山药多糖、海藻酸钠，甘油的吸湿率快速上升，而山药多糖和海藻酸钠上升则较缓慢。

图1 山药多糖、甘油和海藻酸钠的吸湿率变化Figure 1 Changes of moisture absorption rates ofyam polysaccharides，glycerol and sodium alginateA：相对湿度43%；B：相对湿度81%；○：甘油；●：海藻酸钠；△：山药多糖；n=3

2.3 保湿性实验[4，5]将山药多糖、甘油和海藻酸钠烘干至恒重，室温下分别准确称取0.5 g，加入超纯水配制成浓度20%的水溶液，涂布于直径6 cm培养皿底部的透气胶带上，每个样品平行操作3份。将培养皿置于放有干微粉硅胶的干燥器中，温度(23±1) ℃，放置1、2、4、6、8、12、16、24、36、48 h，分别称量样品放置前的水分质量(m0)和放置后水分质量(mm)。按以下公式计算保湿率：保湿率=(mm/m0)×100%。山药多糖、甘油和海藻酸钠在干微粉硅胶环境中的保湿率见图2。由图2可见，0～48 h内保湿率由大到小排列顺序为山药多糖、海藻酸钠、甘油。在0～2 h内，三者保湿率的下降趋势基本一致，之后甘油的保湿率呈现快速下降趋势，在24 h后开始变缓慢。

图2 山药多糖、甘油和海藻酸钠在干微粉硅胶环境中保湿率的变化Figure 2 Changes of moisture retention rates of yam polysaccharides，glycerol and sodium alginate in the dry environment created by dry micronized silica gel○：甘油；●：海藻酸钠；△：山药多糖；n=3

2.4 山药多糖的含量测定[6]

2.4.1 溶液的配制 (1)对照品溶液：称取D-无水葡萄糖对照品适量，加超纯水配制成浓度0.103 0 mg/ml的山药多糖对照品溶液。(2)供试品溶液：称取2.1项下的山药多糖适量，加超纯水配制成浓度0.202 6 mg/ml的供试品溶液。

2.4.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取2.4.1项下的山药多糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置试管中，补充超纯水至1.0 ml，再加入5%苯酚溶液1.0 ml，摇匀后缓慢加入浓硫酸5.0 ml，沸水浴15 min，取出后在冰水中冷却至室温。另取超纯水1.0 ml作为空白对照，同法操作。采用紫外-可见分光光度法，在490 nm波长处测定吸光度(A)。以A为纵坐标，葡萄糖的浓度(c)为横坐标，计算得回归方程A=0.067c+0.029(r=0.999 8)，结果表明D-无水葡萄糖在1.47～14.72 μg/ml范围内呈现良好的线性关系。

2.4.3 精密度实验 精密吸取2.4.1项下的山药多糖对照品溶液0.4 ml，按2.4.2项下操作进行显色反应，用紫外-可见分光光度计在490 nm波长处连续测定6次吸光度，计算得到吸光度的RSD=0.94%(n=6)，表明精密度良好。

2.4.4 加样回收率实验 精密吸取6份已知含量的供试品溶液各0.3 ml，分别加入浓度0.103 0 mg/ml的D-无水葡萄糖对照品溶液0.2 ml，混匀，按照2.4.2项下方法进行显色反应，用紫外-可见分光光度计在490 nm波长处测定吸光度，计算平均加样回收率为99.13%，RSD=1.89%(n=6)，表明该法准确性良好。

2.5 体外透皮吸收实验[7]

2.5.1 离体皮肤的制备 将SD大鼠脱颈处死，用剃须刀机械脱毛，取腹部皮肤，刮去皮下脂肪和黏连物，用生理盐水反复冲洗干净，选择完整皮肤剪成适当大小，置密封塑料袋中，放入-70 ℃超低温冰箱中保存备用。

2.5.2 透皮吸收实验 将大鼠皮肤固定于Franz扩散池的给药室与接收室之间，接收室内径1.8 cm，总容积17 ml，使皮肤表层面向给药室，真皮一侧与接收液接触，同时将气泡排净。吸取浓度10%的山药多糖溶液1.0 ml，置于给药室中，与皮肤密切接触。接收液为生理盐水，用磁转子300 r/min搅拌，水浴温度为37 ℃。在水浴温度达到预设温度时开始计时，分别于1、2、4、6、8、10、12、18、24 h取样，每次取样1.0 ml，同时向接收室补充等体积同温度的接收液。按2.4.2项下方法处理接收液样品，用紫外-可见分光光度计测定吸光度，计算山药多糖的含量，按以下公式计算累积渗透量(Q)。

式中，cm为第m个取样点测得的药物浓度(μg/ml)，V为接收液体积(17 ml)，ci为第i个取样点测得的药物浓度(μg/ml)，Vi为取样体积，A表示释药面积(cm2)。以单位面积的渗透量为纵坐标，渗透时间(t)为横坐标，绘制累积渗透曲线，所得直线斜率为稳态透皮速率(JS，μg·cm-2·h-1)，见图3。由图3可见，在0～24 h内，浓度10%的山药多糖溶液匀速缓慢渗透，JS为12.46 μg·cm-2·h-1，累积渗透率为1.87%。在前12 h内，山药多糖溶液的渗透速率上升较快，12 h后则较平缓。Q=1.460t+10.61(r=0.976 2)，JS=1.460 μg·cm-2·h-1，24 h的累积渗透率为(1.87±0.31)%。

图3 10%山药多糖溶液的透皮吸收曲线Figure 3 Transdermal absorption curve of 10% yam polysaccharide solution

2.5.3 鼠皮中药物滞留量的测定 体外透皮实验结束后，取下鼠皮，冲洗干净，选取有效透皮部分(直径1.8 cm的圆形)，剪碎后加入一定量生理盐水，50 ℃超声(功率300 W)30 min，过滤后将溶液定容至100 ml。吸取1 ml溶液，按2.4.2项下方法处理，用紫外-可见分光光度计在490 nm测定吸光度，计算山药多糖的含量，同时按以下公式计算滞留率。滞留率=Q滞留量/Q总量×100%。结果显示，鼠皮中山药多糖的滞留量为(193.98±31.71) μg，滞留率为(0.60±0.10)%(n=3)。

3 讨 论

本研究发现， 在相对湿度43%和81%的环境下，山药多糖24 h的吸湿率分别为37.6%和48.4%，48 h的吸湿率分别为40.2%和55.3%，表明随着相对湿度上升，其吸湿率提高。山药多糖的吸湿性比甘油弱，但强于海藻酸钠。在干微粉硅胶营造的干燥环境中，山药多糖24 h和48 h的保湿率分别为24.8%和16.5%，其保湿性优于甘油和海藻酸钠。在体外，山药多糖的累积渗透速率为1.460 μg·cm-2·h-1，24 h累积渗透率为(1.87±0.31)%，在鼠皮中的滞留率为(0.60±0.10)%，表明其能够缓慢地经皮渗透，预示透皮吸收性能良好。山药多糖的吸湿性和保湿性与茯苓多糖[4]、金荞麦多糖[5]接近。本研究结果提示，综合考虑山药多糖的吸湿性、保湿性和透皮吸收性，可将其用于护肤保湿剂和创伤修复贴剂的开发应用。