张 颖,闫慧明,彭德举,何亮亮,曹 炜,*

(1.西北大学食品科学与工程学院,陕西西安 710069;2.宝鸡众羊生态牧业有限公司,陕西宝鸡 722400)

羊乳营养价值高、易于消化吸收且具有诸多保健功能,是公认比牛乳更接近人乳的营养佳品。我国是羊乳生产大国,2010年羊乳年产量达27.75万吨,世界排名第13位(FAO统计数据)。关中奶山羊作为我国特有奶山羊品种,主要集中在陕西关中地区,占据了我国羊乳90%以上产量,羊乳产业已成为陕西第二大优势和特色产业[1]。但目前市场上羊乳制品品类单一,主要以羊乳粉为主,在产品开发和基础研究方面极其落后,严重制约了羊乳产业的快速发展。

乳在加热时会发生一系列物理化学变化,如风味变化、营养物质损失、褐变、蛋白质变性、酸度、粘度、脂肪球大小等,从而对乳制品感官品质和稳定性产生影响[2-3]。与牛乳相比,羊乳对加热更加敏感,稳定性差,在热加工过程中尤其高温处理下更容易出现变性、沉淀,成为制约液体羊乳尤其常温长保质期液态羊乳生产的关键技术难题[4-6]。国内外学者对羊乳加热过程已进行一定研究,张富新等[5]探究了不同因素对羊乳酪蛋白热凝固时间的影响;赵丽丽[6]比较了65～137 ℃/7 s六种短时热处理后羊乳酸度、粘度、乳清蛋白变性度、沉淀量和稳定性指数的差异;Pesic 等[7]分析了90 ℃/10 min加热后羊乳中的热诱导蛋白聚合物。然而,目前相关研究局限于几种温度工艺下的热处理,羊乳在乳制品实际加工中常用热杀菌条件处理下品质的变化规律尚未见系统比较。

因此,本研究采用乳品工业中5种常见热杀菌方式,即低温长时巴氏杀菌(65 ℃/30 min)、高温短时巴氏杀菌(72 ℃/15 s)、超巴氏杀菌(95 ℃/5 min)、超高温瞬时灭菌(137 ℃/7 s)和高温高压灭菌(121 ℃/20 min)处理关中羊乳,在测定羊乳蛋白沉淀率、酒精稳定性、pH、红度值、粘度和脂肪球变化的基础上,结合内源荧光光谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,探究热加工对关中羊乳品质的影响,以期为液态羊乳加工技术研究和产品开发提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生鲜羊乳 宝鸡众羊生态牧业有限公司;低分子量蛋白质Marker(14.4～97.4 kDa) 北京索莱宝科技有限公司;丙烯酰胺、N,N-亚甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、三羟甲基甲烷、甘氨酸、硝酸银、无水碳酸钠、乙二胺四乙酸二钠等 均为国产分析纯。

HH-S4电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司;GYB60-6s高压均质机 上海东华高压均质机厂;HWCL-3油浴锅 郑州长城科工贸有限公司;DSX-280KB24高压杀菌锅 上海申安医疗器械厂;Five Easy Plus pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DYCZ-24双垂直蛋白电泳仪 北京六一仪器厂;BK-FL2荧光显微镜 奥特光学有限公司;NDJ-5S旋转粘度计 上海昌吉地质仪器有限公司;Infinite M200PRO酶标仪 瑞士TECAN公司;NS800分光测色计 深圳三恩驰科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 羊乳的预处理及热杀菌处理 生鲜羊乳验收合格后(符合国标GB19301-2010,其中蛋白含量3.05%,脂肪含量3.27%),对其进行真空冷冻干燥成粉末,于-18 ℃保存待用。实验前称取一定量羊乳冻干粉,与蒸馏水1∶7 (w/w)比例混合,40 ℃水浴30 min使之充分复原,然后进行高压均质(均质温度50～60 ℃;均质压力一级20 MPa,二级5 MPa),再分别采用65 ℃/30 min、72 ℃/15 s、95 ℃/5 min、121 ℃/20 min和137 ℃/7 s 5种不同热杀菌方式处理羊乳,杀菌结束后立即采用流动冷水将其冷却至室温,以未经杀菌处理的羊乳作为对照,待分析。

1.2.2 热杀菌处理后羊乳蛋白沉淀率、酒精稳定性、pH、红度值和粘度的测定

1.2.2.1 蛋白沉淀率的测定 参考赵丽丽[6]的方法测定羊乳蛋白沉淀率。空离心管质量记为m0,向离心管中加入10 mL热杀菌处理后的羊乳样品,称其总质量,记为m1。于4 ℃下4000 r/min离心20 min,除去上层脂肪,吸出脱脂乳备用,倒置5～10 min后,再次称其质量记为m2。羊乳离心沉淀率计算公式如下:

离心沉淀率(%)=(m2-m0)/(m1-m0)×100

式中:m0为空离心管质量,g;m1为离心管加乳样质量,g;m2为离心管加底层沉淀质量,g。

1.2.2.2 酒精稳定性的测定 参考赵丽丽[6]的方法测定热杀菌处理后羊乳的酒精稳定性。取1 mL羊乳样品与1 mL不同浓度酒精(60%、68%和72%)混匀,室温下在玻璃皿中观察是否有絮凝沉淀。

1.2.2.3 pH的测定 在25 ℃下用pH计测定热杀菌处理后的羊乳样品的pH。

1.2.2.4 粘度的测定 取30 mL热杀菌处理后的羊乳样品放于测量杯中,选用粘度计0 # 转子,在室温(25 ℃)和剪切速率(60 r/min)下,测定样品粘度,测量一次完毕后,旋转30 °左右再进行第二次测量,共测定8次,取平均值为样品粘度。

1.2.2.5 红度值的测定 采用全自动测色仪测定热杀菌处理后羊乳样品的红度值a*,使用前首先进行黑白校正,然后取10 mL样品放于测量杯中进行测定,每次测定时羊乳样品加入量保持一致。

1.2.3 羊乳脂肪球的显微镜观察 参考孙琦[8]方法观察羊乳脂肪球。取少许羊乳样品于洁净载玻片中央,盖上盖玻片,滴适量香柏油,置于1000×光学显微镜下观察羊乳脂肪球大小和形态。

1.2.4 羊乳蛋白内源荧光光谱分析 参考李子超等[9]的方法,并进行适当修改,分析羊乳蛋白的内源荧光光谱。羊乳样品脱脂后用pH7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释20倍,然后取200 μL稀释后的样品,点样在酶标仪荧光专用96孔黑板上,选取激发波长λex271 nm,手动增益值45,闪光数5次,步宽2 m,测定样品在300～500 nm范围的荧光发射光谱。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 参考Chevallet等[10]方法进行羊乳蛋白SDS-PAGE分析。采用4%浓缩胶和12%分离胶,将不同热杀菌羊乳脱脂后用蒸馏水稀释15倍,与样品缓冲液1∶1混合,沸水加热3～5 min后,上样8 μL。凝胶电泳电压开始设定为80 V,待进入分离胶后调整为120 V。电泳结束后进行银氨染色,终止显色后拍照,并采用Qutity one软件进行蛋白条带光密度分析。

1.3 数据处理

试验重复三次,采用SPSS 19.0软件进行统计学显著性分析,数据以平均值±标准偏差表示,且p<0.05认为存在差异显著。

2 结果与分析

2.1 5种常见热杀菌方式对羊乳蛋白沉淀率、酒精稳定性、pH、红度值和粘度的影响

热杀菌是乳品加工中不可或缺的关键环节,适宜的热处理是保证乳制品流通中质量稳定和符合卫生标准的必要条件[3]。根据热处理工艺参数不同,常见乳杀菌方式有低温长时巴氏杀菌(65 ℃/30 min)、高温短时巴氏杀菌(72～75 ℃/15 s)超巴氏杀菌(80～95 ℃/5～10 min)、高温高压灭菌(121 ℃/20 min)和超高温瞬时灭菌(137～140 ℃/4～10 s)。

2.1.1 5种常见热杀菌方式对羊乳蛋白沉淀率的影响 5种热杀菌对羊乳蛋白沉淀率影响程度存在明显差异,如表1所示。其中高温短时巴氏杀菌(72 ℃/15 s)影响最小,蛋白沉淀率与未加热相比增加不显著(p>0.05);其次为低温长时巴氏杀菌(65 ℃/30 min)、超巴氏杀菌(95 ℃/5 min)和超高温瞬时灭菌(137 ℃/7 s),蛋白沉淀率与未加热相比均显著增加,但三者之间差异不显著(p<0.05);而高温高压灭菌(121 ℃/20 min)则导致蛋白沉淀率最高。这表明热处理强度越大,羊乳蛋白沉淀率越高,热稳定性越低。Raynal-Ljutovac等[11]认为,加热会引起羊乳酪蛋白胶束表面疏水性变化,这是改变羊乳热稳定性的关键因素。另外,羊乳缺乏αs1-酪蛋白,使乳清中自由钙离子含量较高,且羊乳蛋白粒度明显大于牛乳,这些均导致羊乳蛋白比牛乳对热更加敏感,经热处理后沉淀率较高[4,6]。

表1 常见热杀菌方式对羊乳蛋白沉淀率、酒精稳定性、pH、红度值和粘度的影响Table 1 Effect of common thermal sterilization methods on centrifugal precipitation rate, alcohol stability,pH,color value and viscosity of goat milk

2.1.2 5种常见热杀菌方式对羊乳酒精稳定性的影响 由表1可知,在60%酒精浓度下,酒精稳定性试验均呈阴性,说明5种热杀菌羊乳在60%酒精浓度下均稳定;在68%酒精浓度下,仅高温高压灭菌(121 ℃/20 min)沉淀明显,说明高温高压灭菌羊乳在68%酒精浓度下不稳定;而在72%酒精浓度下,酒精稳定性均呈阳性,说明5种热杀菌羊乳在72%酒精浓度下均不稳定。乳品加工中常用酒精稳定性试验检验乳新鲜度,从而反应乳体系的稳定状况,一般牛乳采用72%酒精、羊乳采用68%酒精来进行。研究认为,热处理羊乳的酒精稳定性变化与加热过程中酪蛋白水化作用和电荷变化有关[12-13]。本研究表明,羊乳的酒精稳定性随着热处理强度增大而显著降低,高温高压灭菌对羊乳酒精稳定性破坏最大,蛋白沉淀率也最高,说明高温高压灭菌下羊乳内部稳定体系会发生显著变化,可能预示着高温高压灭菌不适合于液态羊乳制品加工。

2.1.3 5种常见热杀菌方式对羊乳pH、压红度值和粘度的影响 由表1也可看出,低温长时巴氏杀菌(65 ℃/30 min)、低温短时巴氏杀菌(72 ℃/15 s)、超巴氏杀菌(95 ℃/5 min)和超高温瞬时灭菌(137 ℃/7 s)对羊乳pH和红度值影响不显著,而高温高压灭菌(121 ℃/20 min)则导致pH显著下降、红度值显著增加(p<0.05),但5种杀菌工艺对粘度均没有显著影响(p>0.05)。加热时,乳中可溶性钙磷向胶体性钙磷转变、乳糖受热降解、美拉德反应发生等,均可导致体系pH降低[14]。美拉德反应随热处理强度增大而加剧,尤其高温条件下乳中发生美拉德反应的蛋白质种类以及蛋白质美拉德位点数均会大幅增加,褐变程度加剧,从而导致红度值升高[15]。pH下降和红度值增加预示着乳品质的变劣,本研究表明高温高压灭菌(121 ℃/20 min)对羊乳品质影响较大。

2.2 5种常见热杀菌方式对羊乳脂肪球的影响

脂肪球微粒大小对乳的外观、口感和稳定性有着重要影响[16]。采用光学显微镜观察5种杀菌方式羊乳中脂肪球的差异,如图1所示。与未加热相比,低温长时巴氏杀菌(65 ℃/30 min)、低温短时巴氏杀菌(72 ℃/15 s)和超巴氏杀菌(95 ℃/5 min)后羊乳脂肪球表观直径略微增大,而高温高压灭菌(121 ℃/20 min)和超高温瞬时灭菌(137 ℃/7 s)的高强度杀菌,则导致羊乳脂肪球直径减小,尤以高温高压灭菌减小更加明显。这与周洁瑾等[17]对牛乳的研究结果相似,巴氏杀菌牛乳脂肪球因聚集而变大,而超高温灭菌牛乳脂肪球破裂、直径变小。在加热过程中,乳脂肪球膜会通过二硫键吸附变性乳清蛋白造成脂肪球表观直径增大,但在高强热处理时,发生脂肪球膜破裂和脂肪球变形,导致其直径减小[16-19]。

2.3 5种常见热杀菌方式对羊乳蛋白质内源荧光光谱的影响

色氨酸(Trp)残基是蛋白质中重要的内源荧光来源,Trp中生色团对其所处微环境极性非常敏感,因此利用蛋白质内源荧光光谱的变化可以反映其三级结构的改变[20]。图2显示的是5种杀菌方式处理羊乳的内源荧光发射光谱,从图2可以看出,与未加热相比,5种热杀菌方式处理均导致羊乳蛋白内源荧光强度(If)增大,但低温长时巴氏杀菌(65 ℃/30 min)、低温短时巴氏杀菌(72 ℃/15 s)、超巴氏杀菌(95 ℃/5 min)和超高温瞬时灭菌(137 ℃/7 s)仅使If微弱升高,且四种杀菌羊乳内源荧光图谱非常接近,而高温高压灭菌(121 ℃/20 min)则导致羊乳蛋白If剧烈增大。内源荧光强度增加说明5种热杀菌使羊乳蛋白中Trp所处环境极性减小,Trp分子内猝灭减弱,从而导致体系If增大,并且高温高压灭菌对羊乳蛋白结构影响最大,羊乳蛋白中有更多Trp分子暴露于疏水环境[21]。

图2 常见热杀菌方式对羊乳蛋白质内源荧光光谱的影响

2.4 5种常见热杀菌方式对羊乳蛋白质SDS-PAGE图谱的影响

图3所示的是5种常见热杀菌方式羊乳蛋白质经银氨染色后SDS-PAGE图谱。与牛乳一样,羊乳主要含有酪蛋白和乳清蛋白两类蛋白,其中酪蛋白又分为β-酪蛋白(β-CN)、αs1-酪蛋白(αs1-CN)、αs2-酪蛋白(αs2-CN)和κ-酪蛋白(κ-CN),乳清蛋白则包括β-乳球蛋白(β-LG)、α-乳白蛋白(α-LA),此外,还存在微量的免疫球蛋白(LgG)、乳铁蛋白(LF)和血清白蛋白(BSA)(图3)。

图3 常见热杀菌方式对羊乳蛋白质SDS-PAGE图谱的影响

由图3可以看出,与未加热相比,低温长时巴氏杀菌(65 ℃/30 min)、低温短时巴氏杀菌(72 ℃/15 s)、超巴氏杀菌(95 ℃/5 min)和超高温瞬时灭菌(137 ℃/7 s)对β-CN条带影响不明显,高温高压灭菌(121 ℃/20 min)则使其光密度微弱减小;αs1-CN、αs2-CN和κ-CN在巴氏杀菌和超巴氏杀菌处理下变化不大,然而在高温高压灭菌和超高温瞬时灭菌条件下,αs1-CN和αs2-CN发生明显降解,尤其以高温高压灭菌降解程度最大,而κ-CN在超高温瞬时灭菌下发生聚集,在121 ℃/20 min下则出现更明显的蛋白聚合和碎片。对于β-LG,低温短时巴氏杀菌处理时无明显变化,低温长时巴氏杀菌和超巴氏杀菌下略有减少,但在高温高压灭菌和超高温瞬时灭菌后则明显降解,尤其高温高压灭菌时降解更多;而对于α-LA,超高温瞬时灭菌下同样出现明显降解,但在高温高压灭菌强热处理时则几乎完全消失(图3)。另外,对于高温高压灭菌和超高温瞬时灭菌,50 kDa以上以及14.4～22 kDa区间出现明显蛋白聚合物或碎片,高温高压灭菌更为明显(图3)。整体来看,巴氏杀菌对羊乳酪蛋白和乳清蛋白影响均较小,超巴氏杀菌乳清蛋白开始变性、聚集或部分降解,而超高温瞬时灭菌和高温高压灭菌下乳清蛋白明显降解甚至消失,酪蛋白表现出明显的聚集和解聚现象,尤其高温高压灭菌时变化最为剧烈。

目前,关于羊乳在加热过程中尤其高温处理下乳蛋白变化机制研究非常有限,而牛乳相关研究表明,牛乳酪蛋白含有较高比例脯氨酸,其会阻止热变性凝固所必需氢键的形成,因而对热相对稳定;乳清蛋白对加热比较敏感,加热首先使β-LG变性,然后变性β-LG通过二硫键等方式与酪蛋白微粒结合,当加热温度达到80 ℃以上时,α-LA开始变性与酪蛋白发生结合,且随加热温度升高更多α-LA和β-LG络合于酪蛋白胶体表面;高热处理下(120～140 ℃)酪蛋白胶束体系嫡发生改变,氢键破坏,疏水性增强,胶束发生聚合或者解聚作用[22-23]。Henry等[24]研究发现,80 ℃/10 min和115 ℃/20 s热处理下羊乳酪蛋白胶束和β-LG之间会形成三种共价键。Pesic等[7]研究90 ℃/10 min加热牛、羊乳中的热诱导蛋白聚合物时,发现两种乳中变性β-LG、a-LA、κ-CN在乳清相和酪蛋白胶束相分布存在明显差异。这预示着羊乳蛋白虽与牛乳一样在低强度加热时发生变性,高强热处理时出现聚集和解聚,牛、羊乳蛋白质在热加工过程中的变化存在相似之处,但羊乳蛋白在加热过程中具体的变性、解聚和聚合机制仍有待深入研究。

3 结论

本文研究了5种乳品工业中常用热杀菌方式对关中羊乳品质的影响。结果发现:高温高压灭菌羊乳蛋白沉淀率最高、酒精稳定性最差、pH明显下降、红度值明显增大。5种杀菌方式对粘度没有显著影响(p>0.05);羊乳脂肪球经巴氏杀菌后表观直径略微增大,而超高温瞬时灭菌和高温高压灭菌则导致其直径明显变小,高温高压灭菌更为明显。荧光光谱表明,羊乳经不同热杀菌后蛋白空间结构改变存在差异,其中高温高压灭菌后内源荧光强度剧烈增大。SDS-PAGE显示,巴氏杀菌对羊乳酪蛋白和乳清蛋白影响均较小,超巴氏杀菌乳清蛋白开始变性、聚集或部分降解,而超高温瞬时和高温高压灭菌下,则导致乳清蛋白明显降解甚至消失,酪蛋白出现聚集和解聚,高温高压杀菌更为明显。由此可见,高温高压灭菌和超高温瞬时灭菌,尤其是高温高压灭菌对关中羊乳品质影响较大,超巴氏杀菌影响次之,而巴氏杀菌则对其影响较小。