张 庆,袁 源,邓扬龙,周翔宇,李玉锋

(西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039)

银耳(TremellafuciformisBerk)又被叫作银耳子、白木耳、雪耳等,属真菌类银耳科银耳属,是门担子菌门真菌银耳的子实体,有“菌中之冠”的美称[1]。银耳的栽培方式主要有段木栽培和代料栽培[2],前者以四川通江银耳闻名,后者则多以福建古田银耳居多。段木栽培即选用较适宜银耳生长的树木,剔去多余枝丫,锯成约1米左右的木段,晾晒半月后进行钻孔,再点入菌种,让银耳自然生长,一年采收一次[3]。而代料栽培则是在有效控制室内温度、湿度的条件下充分利用经切碎磨粉后的树枝,木段或残余木料等农副产品为原料,麦皮、米糠、石膏等为辅助原料,进行袋装或瓶装栽培[4]。此法节省大量木材,原料来源充足,栽培周期短,既有利于提高农产品的利用价值,又有利于扩大银耳栽培的范围,不受有无林区条件的限制。

据国内外的药理作用研究,银耳多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、促进神经细胞生长及改善记忆力等多方面活性[5]。目前,国内外大多数学者对银耳的研究主要集中在银耳多糖的生理活性等方面。由于段木银耳和代料银耳栽培方式、生长环境不同,所以其外观、营养指标、生物活性可能会存在一定的差异。现如今对于这方面的研究与报道甚少,对不同栽培方式下银耳多糖物质含量、生物活性功能等方面尚未进一步认识。

针对上述研究不足,本试验通过碱式提取代料和段木两种栽培方式银耳的多糖,测定多糖生物活性、理化性质,比较两种栽培方式银耳理化性质的差别,并针对其内在特征差异进行分析,以期为今后银耳多糖进一步深入研究奠定基础,并对银耳资源有效利用、产业化开发和生产加工提供一定的参考价值和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

段木银耳干样 四川通江古林银耳有限公司,含水率为11.7%;代料银耳干样 四川天科生态农业有限公司,含水率为15.2%;氢氧化钠、石油醚、无水乙醇、95%乙醇、氯仿、正丁醇、乙酸酐、吡啶、乙酸酐、无水葡萄糖、邻苯二甲酸氢钾、EDTA 以上均为分析纯,成都市科龙化工试剂厂;间羟基联苯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司,生化试剂;考马斯亮蓝 南京建成生物工程研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(含量99%以上) 梯希爱上海化成工业发展有限公司(TCI);L-岩藻糖(Fucose,Fuc) 诗丹德生物制药有限公司;D-葡萄糖(Glucose,Glc)、D-半乳糖(Galactose,Gal)、D-木糖(Xylose,Xyl)、L-鼠李糖(L-rhamnose monohydrate,Rha)、D-葡萄糖醛酸(Glucuronic acid,GlcA)、D-甘露糖(Mannose,Man) 上海安谱实验科技股份有限公司。

TB-214电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;HH-600型数显三用水箱 金坛富华仪器有限公司;RE-52AA酸度计、RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;FDU-1100真空冷冻干燥机 东京理化器械株式会社.;PHS-3C型紫外分光光度计 方舟科技有限公司;SFG-02.400电热恒温鼓风干燥箱 黄石市恒丰医疗器械有限公司;D2F-6021真空干燥箱 上海一恒科技有限公司;7820A气相色谱仪 安捷伦;Heto3410超低温冰箱 上海百蕾真生物科技有限公司;TDZ5-WSTDZ5-WS离心机 湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖提取与初步纯化 干银耳粉碎过80目筛→碱液提取→提取蒸发浓缩→脱蛋白→醇沉→冻干→透析→冻干→银耳精多糖

1.2.1.1 粗多糖的提取 采用碱式提取法提取粗多糖。将段木银耳与代料银耳干样分别粉碎过80目筛后各取1 g,加入0.7 mol/L NaOH溶液,混匀,80 ℃水浴2 h。四层纱布过滤,保留滤液。重复上述步骤三次,三次提取料液比分别为1∶150、1∶100、1∶100 g/mL。将碱提液用0.1 mol/L盐酸中和至pH=7.0,中和后的溶液蒸发(55 ℃,真空度0.09 MPa)至约100 mL[6-7]。

1.2.1.2 多糖的分离纯化 sevage法脱蛋白:按吴振亚[8]的方法,稍作改动。振荡时间为4 h,重复除蛋白操作6次。可用考马斯亮蓝G-250检测,当样品反应液与空白对照(样品替换为等体积蒸馏水，其他完全相同)颜色相同时,即为蛋白质除尽。

醇沉与透析:按一定比例(样液∶乙醇=1∶4,V/V)加入乙醇,于4 ℃低温中冷藏24 h。取出后,回收乙醇,将絮状物挑出,置于容器中。所得絮状物放入超低温冰箱(-60 ℃)中预冻约6 h,迅速取出预冻后的样品,冻干4～5 h备用。将透析袋在50%的乙醇中煮沸1 h,用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和1 mol/L EDTA(pH=8)溶液洗涤,最后用蒸馏水冲洗备用。将冻干银耳多糖配成10 mg/L溶液装入透析袋中,留1/2的体积,两头用透析夹加紧,放在去离子水中透析。每隔1 h换一次去离子水,然后减慢更换频率。24 h后取出再冻干,得段木银耳多糖与代料银耳多糖的初纯物,待测。

1.2.2 蛋白质残留量的测定 取六支试管编号,按顺序加入0、20、40、60、80、100 μL 1.0×103μg/L标准蛋白质溶液(牛血清蛋白),再加入100、80、60、40、20、0 μL的0.9%生理盐水。各加入考马斯亮蓝G-250试剂3.0 mL,充分接触,孵育5 min,测定A595值。以标准蛋白质含量为横坐标,A595值为纵坐标,绘制标准曲线。

各吸取银耳多糖初纯物三份,配制为浓度10 mg/mL,加入考马斯亮蓝G-250试剂3.0 mL,充分混匀,孵育5 min后,测定A595值。根据A595值,在标准曲线上求出样品中蛋白质含量。以水作为空白对照。以蛋白质含量为横坐标,吸光值为纵坐标,得到蛋白含量曲线。

1.2.3 多糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法测定银耳提取液中多糖含量[9]。葡萄糖标准曲线绘制:采用60 ℃烘干至恒重的无水葡萄糖为标品,绘制标准曲线;将样品稀释至3～10倍,用分光光度法测定其吸光值,结合以下公式得多糖含量。

多糖含量(mg/mL)=葡萄糖含量×稀释倍数×0.9×100(0.9为校正系数)

运用曾丽萍等[10]的方法测定多糖的得率。

多糖得率(%)=多糖含量×稀释倍数/样品干重×100

1.2.4 多糖硫酸根、糖醛酸含量的测定 运用吴琼等[11]的方法,采用硫酸钡-比浊法测定多糖中硫酸根含量,称取干燥至恒重的K2SO4测定绘制得标准曲线,多糖样品溶液为5 mg/mL。

运用姜瑞芝等[12]的方法,采用间羟基联苯法测定多糖中糖醛酸含量,称取60 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖醛酸标准品测定绘制得标准曲线,多糖样品溶液为5 mg/mL。

1.2.5 多糖的单糖组成测定与分析 样品预处理[13]:准确称取5 mg多糖样品于试管中,加入2 mL 2 mol/L的硫酸将其溶解,于110 ℃条件下水解8 h,滴入2 mol/L的NaOH调节pH至中性,再加入4%的硼氢化钠,室温反应1.5 h,缓慢加入冰醋酸直至无气泡产生。再复浓缩,直至将酸除尽。将稀释的样品真空冷冻干燥24 h,加吡啶及正丙胺各1 mL,混匀,于55 ℃下水浴30 min,真空冷冻干燥24 h,再加入吡啶及乙酸酐各0.5 mL,混匀,于95 ℃条件下水浴1 h,氮气吹干,经真空冷冻干燥24 h后以氯仿溶解,进行GC分析。

单糖标准品处理:称取葡萄糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖酸各10 mg,混合,与上述步骤一致。以单糖乙酰化产物峰面积为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线[14]。

气相色谱法(GC)条件:进样口温度248 ℃,检测器温度281 ℃,载气为99.99%高纯氮气,控制气体流速为0.6 mL/min;分流进样,分流比为20∶1,进样量5 μL;升温程序:200 ℃保持2 min,以3 ℃/min的速率升至245 ℃,再以10 ℃/min的速率升至275 ℃,保持2 min[15]。

1.2.6 多糖的抗氧化活性测定

1.2.6.1 银耳多糖DPPH自由基清除能力测定 运用刘培勋等[16]、Deng等[17]的方法进行银耳多糖DPPH自由基清除能力的测定。取银耳多糖样品配制为5 mg/mL,置于10 mL离心管中,加入无水乙醇稀释的0.004%的DPPH溶液3.0 mL,室温避光反应30 min,平行以无水乙醇为空白对照,3000 r/min离心10 min,取上清液,于517 nm波长处测定吸光值并记录,将样品放置0.5、1.0、1.5、2.0 h然后每隔2 h测定一次直到18 h后在517 nm测定吸光值,记录数据,以5 mg/mL VC为阳性对照。根据吸光值大小,得出DPPH自由基清除率随时间变化的规律。

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(As-Ac)/A0]×100

式中,A0:1.0 mL蒸馏水+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值;As:1.0 mL样品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值;Ac:1.0 mL样品溶液+3.0 mL无水乙醇的吸光度值。

1.2.6.2 银耳多糖羟自由基清除能力测定 参考运用张泽生等[18]、陈英红等[19]、颜军等[20]的方法进行羟自由基清除能力测定;取提取液1 mL,依次加入5 mmol/L邻二氮菲溶液1 mL,0.2 mol/L PBS(pH=7.4)2 mL,5 mmol/L FeSO4溶液和0.1% H2O2各1 mL,于37 ℃反应60 min,4000 r/min离心10 min,于536 nm处测定吸光值。银耳提取液清除羟自由基的能力与同浓度VC的比较,结果用VC等价抗氧化能力VEAC(VCequivalent antioxidant capacity)表示。

羟自由基清除率(%)=(Ao-Ax+Axo)/Ao×100

式中:Ao-空白对照组的吸光度;Ax-待测液的吸光度;Axo-不加入显色剂H2O2的待测液的本底吸收值。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行数据处理，所有实验均重复操作3次，结果采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同栽培方式银耳多糖各项营养指标分析

2.1.1 不同栽培方式银耳多糖中蛋白质残留量 图1为蛋白质标准曲线。由图1得到回归方程为y=0.008x+0.0348(R2=0.9918),由所测试验数据计算得不同栽培方式银耳多糖中蛋白质残留量如图2所示。

图1 蛋白质标准曲线

图2 不同栽培方式银耳多糖中的蛋白质残留量

由图2可知,两种银耳在纯化后蛋白质含量存在显著差异(p<0.05),代料银耳蛋白质含量(2.65±0.05 mg/mL)显著高于段木银耳(0.45±0.06 mg/mL)(p<0.05)。说明两种栽培方式银耳在某些限定营养成分方面存在一定的差异。

2.1.2 不同栽培方式银耳多糖得率 以吸光度为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标绘制的标准曲线如图3所示。根据图3,得回归方程为:Y=0.0056X+0.0027,R2=0.9998。在脱蛋白后和透析后两种不同栽培方式银耳多糖得率及含糖量测定结果如表1。

图3 葡萄糖溶液标准曲线

根据表1得出,脱蛋白后,段木银耳的多糖得率显著高于代料银耳(p<0.05),分别为28.66%±2.33%、26.18%±1.13%;代料银耳的含糖量显著高于段木银耳(p<0.05),分别为50.32%±1.61%、46.57%±0.46%。透析后,段木银耳的多糖得率显著高于代料木耳(p<0.05),含糖量无显著差异(p>0.05),且都超过了80%。透析前后的多糖含糖量(等同纯度)存在明显差距,且透析后远高于透析前,可以推测出透析为除去蛋白质的重要过程,且试验透析结果较优。

表1 不同栽培方式银耳多糖得率及含糖量Table 1 Polysaccharide yield and sugar content in different cultivation methods of Tremella fuciformis

2.1.3 不同栽培方式银耳多糖硫酸根离子、糖醛酸含量 根据标准曲线(图4),计算得回归方程为:Y=0.2176X+0.0031,R2=0.9911。

图4 硫酸根含量标准曲线

根据标准曲线(图5),计算得回归方程为:Y=0.0102X+0.0096,R2=0.9978。

图5 葡萄糖醛酸标准曲线

代料与段木银耳糖醛酸、硫酸根含量(%)如图6。由图6可知,段木银耳硫酸根含量和糖醛酸含量都高于代料银耳,由差异性分析表明存在显著性差异(p<0.05),由此推断栽栽培方式的不同对银耳硫酸根、糖醛酸含量均有一定的影响。

图6 不同栽培方式银耳多糖硫酸根、糖醛酸含量

硫酸根和糖醛酸含量被较多文献报道证实与生物活性为正相关的关系[21]。而糖醛酸的含量是判断此多糖是否为酸性多糖的一个重要指标。硫酸根属于多糖的一个特征基团,带有硫酸基团的糖的复合物(如蛋白聚糖、糖蛋白以及硫酸酯化多糖)是一大类很重要的活性物质,具有提供机体的细胞免疫、抗病毒和体液免疫功能以及延缓衰老等作用。王琪[22]的报道证实,多糖中硫酸根含量与其功效有密切联系,同时硫酸根含量越高,功效越好。

2.2 不同栽培方式银耳多糖的单糖组成分析

2.2.1 各单糖标准品气相色谱图 各单糖标准品气相色谱图见图7。

图7 各单糖标准品的气相色谱图

2.2.2 碱提法所得不同栽培方式银耳多糖的单糖组成及图谱

表2 单糖标准曲线

Table 2 Standard curve of monosaccharide

单糖组成线性方程决定系数R2鼠李糖y=4.110x-0.13210.9978岩藻糖y=2.795x-10.8960.9976甘露糖y=4.898x-3.47750.9988木糖y=5.111x-4.23460.9989半乳糖y=6.132x-22.4350.9908葡萄糖y=5.243x-11.3010.9945葡萄糖醛酸y=4.460x-19.1870.9955

由表3、图8可知,两种栽培方式银耳多糖均含有甘露糖、葡萄糖、木糖、葡萄糖酸。其中代料与段木栽培方式中甘露糖含量都最多,其次是木糖和葡萄糖,且代料栽培银耳的甘露糖、木糖与葡萄糖含量都大于段木栽培银耳,葡萄糖醛酸含量差别不明显。银耳多糖的单糖组成是决定银耳多糖一级结构的重要指标,碱式提取的两种银耳多糖的单糖结构无较大差别,即多糖结构特征亦无太大差别,其他单糖含量均较少,所以由实验结果推测,此银耳多糖可能是以甘露糖为主链,木糖和葡萄糖醛酸等单糖作为辅链的酸性杂多糖。

图8 碱提法所得银耳多糖的气相色谱图

表3 不同栽培方式银耳多糖的单糖组分Table 3 Monosaccharide components of Tremella fuciformis in different cultivation methods

2.3 不同栽培方式银耳多糖的抗氧化活性分析

2.3.1 不同栽培方式银耳多糖清除DPPH自由基的能力 不同栽培方式银耳多糖DPPH自由基清除率随放置时间的变化曲线如图9所示。由图9可知,随着反应时间增大,DPPH自由基清除率也逐渐增大,最后在一个范围内无太大波动,说明时间越长,对自由基的清除能力越趋于稳定。在反应5～10 h时间段内,DPPH自由基清除率迅速增大,且在反应时间13 h之后趋于稳定,由此可得反应时间为13 h最佳。由图9可知,VC对于DPPH自由基的清除率为68.57%,在两种银耳DPPH清除率趋于稳定时,段木银耳多糖的DPPH自由基清除率比代料银耳高3%,二者分别为44.80%、41.80%。

图9 不同栽培方式银耳多糖DPPH自由基清除率随放置时间的变化

2.3.2 不同栽培方式银耳多糖清除羟自由基的能力 结合图10～图11进行差异性分析可知,两种栽培方式银耳对于羟自由基的清除率无显著性差异(p>0.05),代料银耳羟自由基清除率比段木银耳高0.25%,二者分别为46.82%±0.08%、46.57%±1.60%。表明采用相同提取方法时,两种银耳多糖的抗氧化能力无显著差异,猜测其生长环境与栽培方式对抗氧化能力无太大影响;但可能在不同提取方式下会有差异,这部分研究有待进一步深入。

图10 VC清除羟自由基的标准曲线

图11 不同栽培方式银耳多糖羟自由基清除率

3 结论

本试验采用碱提法提取代料银耳和段木银耳多糖,通过测定多糖的理化性质及体外抗氧化活性,比较两种栽培方式银耳生物活性以及理化性质的差异。结果表明,透析后的多糖蛋白质含量极少,可以认为纯化后多糖中几乎不含蛋白质。由质量比结果分析可推测,银耳多糖是以甘露糖为主链,木糖、葡萄醛酸为辅链的酸性杂多糖,代料银耳与段木银耳多糖中葡萄糖的质量比为13.62∶2.43。单糖组成影响着多糖的结构,单糖组成的不同表明化学组成不同,由此可推测得出两种栽培方式银耳化学组成无太大差异。根据对银耳多糖的硫酸根含量、糖醛酸含量、DPPH自由基和羟自由基清除能力的测定可知,段木银耳多糖和代料银耳多糖在碱式提取下生理活性差异基本不明显,由此可得出不同栽培方式对多糖抗氧化活性无太大影响。由结果可知,银耳多糖在DPPH自由基与羟自由基清除能力中起着主导作用,可作为一种天然的自由基清除剂。