宋永安，张雪燕，徐志伟，张晓菊

郑州大学人民医院 呼吸内科(郑州 450000)

肺癌是常见的恶性肿瘤，病死率高，5年生存率<15%[1]。由于肺癌患病因素多、预后差，其治疗难度较大。目前，最常见的肺癌类型是非小细胞肺癌(NSCLC)，约占所有肺癌的85%[2-3]。新发的非小细胞肺癌(NSCLC)患者中约40%为临床Ⅳ期肺癌，姑息性化疗的中位生存期仅为8～11个月，发生转移的非小细胞肺癌通常被认为无法治愈[4]。因此，寻找更好的临床疗法来治疗肺癌非常迫切。安罗替尼是我国正大天晴药业集团自主研发的一种新型小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂[5]，能有效抑制VEGFR、PDGFR等激酶[6]，具有抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的作用，目前多种癌症临床试验正在开展当中[7-8]。肺癌细胞的增殖、侵袭转移是肺癌患者高病死率的主要原因，寻找更好的方法抑制肺癌细胞的增殖、侵袭转移一直是肺癌治疗研究的重点[9]。A549细胞系是体外最常见的非小细胞肺癌细胞系，本研究首次发现安罗替尼在体外能够抑制肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭，有望为治疗非小细胞肺癌提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 一般材料

人肺癌A549细胞购自中国科学院细胞库(上海)；安罗替尼购自MCE有限公司(美国)；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自BI公司(以色列)；CCK8试剂购自日本同仁有限公司(日本)；凋亡检测试剂盒购自凯基生物有限公司(中国)；Transwell小室购自康宁公司(美国)；细胞培养皿和细胞培养板购自耐思生物科技公司(无锡)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将A549细胞用RPMI 1640完全培养基在培养箱中常规培养。完全培养基中含体积分数10%的胎牛血清。所有细胞约4 d传代1次，隔1 d更换一次培养基，细胞处于对数期时用于实验。

1.2.2 不同浓度安罗替尼对A549细胞增殖的影响 收集对数生长期的A549细胞，用培养基稀释后均匀加至96孔板中，每孔细胞数为3 500个。24 h后，加入含不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)安罗替尼的培养基作为实验组，另外设置不加安罗替尼的阴性对照组。安罗替尼作用24、48或72 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃孵育4 h，然后用酶标仪450 nm波长处测定吸光度(n=3)。按照CCK8试剂盒说明书计算各组中A549细胞的生存率。

1.2.3 安罗替尼对A549细胞凋亡的影响 将消化下来的A549细胞以每孔5×105细胞接种于6孔板，过夜后加入含有不同浓度(0、4、8、16 μmol/L)安罗替尼的培养基再培养48 h。用不含EDTA的胰酶消化A549细胞，并用遇冷的PBS洗涤3次，收集细胞。在每组细胞中先加入5 μL Annexin V-FITC和500 μL缓冲液，混匀后再加入5 μL PI溶液。充分混匀后在室温避光染色20 min。用流式细胞仪器收集1万个细胞，根据试剂盒染色情况分析细胞凋亡情况(n=3)。

1.2.4 划痕实验检测各组细胞的迁移能力 A549细胞以6×105个/孔接种于6孔板中，等到细胞长至约90%时，用无菌200 μL枪头沿孔板中央划一条直线，PBS清洗后，用含有不同浓度(0、1、2、4 μmol/L)安罗替尼的无血清培养基分组培养。分别在0、48 h用显微镜拍照，划痕宽度用ImageJ软件计算(n=3)。迁移率=1-48 h的划痕宽度/0 h的划痕宽度×100%。

1.2.5 Transwell细胞侵袭转移实验 先在24孔板各孔中加600 μL含20%血清的培养基，然后取出Transwell侵袭小室，放入24孔板各孔中，在Transwell小室内加入基质胶。等到基质胶凝固后将消化下来的A549细胞按每孔5×104个细胞接入Transwell小室，分组培养，小室中加入无血清培养基，使终体积为400 μL。Transwell小室和24孔板中均含有相同浓度的安罗替尼。在培养箱中培养48 h，弃去培养基。取出小室，用棉签擦去小室内未穿过的细胞。24孔板中加4%多聚甲醛，并将Transwell小室浸入，室温固定15 min，PBS清洗3次。移去小室，倒置风干。然后在24孔板中加入配置好的700 μL dipy溶液，将小室浸入其中，室温避光染色15 min。取出小室，用PBS清洗3遍，并在显微镜下观察(n=3)。每个小室取3个不同视野进行拍照，ImageJ软件计数。实验独立重复3次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 安罗替尼抑制A549细胞增殖

安罗替尼能抑制A549细胞的增殖(图1)，A549细胞的抑制率随着安罗替尼浓度的增加而增加，且安罗替尼作用时间越长，抑制作用越强，显示出了时间依赖性。24 h的IC50值为43.82 μmol/L，48 h的IC50值为13.27 μmol/L，72 h的IC50值为6.47 μmol/L，显示出了良好的细胞增殖抑制作用(表1)。

表1 安罗替尼对A549细胞增殖的影响

注：与0 μmol/L安罗替尼组比较，*P<0.05，与0 μmol/L安罗替尼组比较，**P<0.01

2.2 安罗替尼促进A549细胞凋亡

通过流式细胞术检测安罗替尼对A549细胞凋亡的影响。发现处理48 h后A549细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均有升高，其中晚期凋亡率比早期凋亡率升高的更显著(表2、图2)，说明安罗替尼可促进A549细胞凋亡来降低A549细胞的生存率。

表2 安罗替尼促进A549细胞凋亡

注：与0 μmol/L安罗替尼组相比，*P<0.05，与0 μmol/L安罗替尼组相比，**P<0.01

图2 安罗替尼对A549细胞凋亡的影响

2.3 安罗替尼抑制A549细胞迁移

各组细胞在0 h和安罗替尼处理后48 h用显微镜拍照观察细胞迁移情况。安罗替尼作用后A549细胞迁移能力降低，并且随着安罗替尼浓度增加，细胞迁移率逐渐降低(图3)，说明安罗替尼以浓度依赖的方式抑制A549细胞迁移。

图3 安罗替尼抑制A549细胞迁移注：A：划痕实验迁移图(光学显微镜，×10)；B：各组的迁移率。两两比较，*P<0.05，**P<0.01

2.4 安罗替尼抑制A549细胞侵袭

用Transwell实验评价安罗替尼对A549细胞侵袭能力的影响，观察到安罗替尼作用48 h后，穿过Transwell小室膜的细胞相对于对照组减少(图4)，说明A549细胞的侵袭能力受到抑制且安罗替尼浓度越高，侵袭抑制作用越强。

图4 不同浓度安罗替尼对A549细胞侵袭能力的影响注：A：Transwell图(光学显微镜，×20)；B：各组中单个视野平均细胞数。两两比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

肺癌是危害人类健康的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌病例的80%以上，目前整体5年生存率<15%[10]。肺癌的特征在于细胞不受控制的增殖，最常见的是上皮细胞(癌)[11]。患有晚期NSCLC的患者平均在诊断后18个月内死亡，转移性传播占死亡病例的70%以上[12]。肺癌细胞的增殖和转移是肺癌患者高病死率的最主要原因，因此抑制肺癌细胞增殖、转移是肺癌治疗的重点。

A549细胞是体外实验常用的非小细胞肺癌细胞系，本研究首次发现安罗替尼能抑制非小细胞肺癌系A549增殖、迁移和侵袭。肿瘤细胞的增殖往往与抵抗凋亡有关，肿瘤细胞可通过各种途径逃避凋亡，使正常的凋亡通路失去功能，从而促进肿瘤细胞的发生和增殖[13]。本研究发现，安罗替尼对A549细胞增殖具有强烈的抑制作用，72 h的IC50值仅为6.47 μmol/L。本研究又用凋亡双染法检测了A549细胞的凋亡情况，发现安罗替尼浓度依赖性(4、8、16 μmol/L)地增加A549细胞凋亡比例，说明抑制A549细胞增殖作用与促进其凋亡有关。

杨斌等[14]发现安罗替尼能够抑制肝癌细胞HCCC-9810的转移与侵袭。平板划痕实验和Transwell实验可评价细胞在体外的迁移、侵袭能力，平板划痕实验和Transwell实验发现安罗替尼在低于IC50浓度时(1、2、4 μmol/L)便可以抑制A549细胞的迁移和侵袭，用4 μmol/L安罗替尼处理，A549细胞几乎失去侵袭能力。

综上所述，安罗替尼是我国自主研发的靶向药，副作用小，该实验首次发现了安罗替尼在体外对非小细胞肺癌A549增殖、迁移侵袭的抑制作用，有望为安罗替尼治疗非小细胞肺癌提供新的理论基础。