华海侠，刘瑞吉，于晓麟，赵 敏

1.秦皇岛市第一医院 肿瘤内科(秦皇岛 066000);2.秦皇岛市第一医院 呼吸内科(秦皇岛 066000);3.秦皇岛市第一医院 病理科(秦皇岛 066000)

上皮间质转化(epithelial interstitial transformation,EMT)是指上皮细胞失去原有上皮细胞特征，紧密连接消失，极性紊乱，进而获得间质细胞表型，迁移和侵袭能力提高的生理性和病理性状态在肿瘤发生、发展中起到重要的调控作用，是肿瘤干细胞的形成和肿瘤放化疗耐性的重要因素[1]。主要特征为上皮标记物E-钙黏蛋白表达减少，间质表型波形蛋白表达上调，并与转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)相关信号转导通路关系密切，其中Snail蛋白是公认的EMT发生的重要转录调控因子之一[2]。研究[3]表明，作为一种跨膜硫酸肝素蛋白聚糖，多配体蛋白聚糖2(syndecan-2,SDC2)能够与生长因子及其受体相结合，如TGF-β1促进其与受体结合激活相应信号转导通路。已有研究显示，SDC2在结肠癌[4]、食管癌[5]、前列腺癌[6]等恶性肿瘤中高表达，能够促进肿瘤细胞黏附、迁移和侵袭。因此本研究拟通过合成针对SDC2的小干扰RNA(small interfere RNA,siRNA)，观察基因沉默SDC2对TGF-β1介导的肺癌A549细胞发生EMT的作用及其机制，为研究SDC2参与肿瘤EMT的作用机制，以及其作为潜在的药物作用靶点提供一定的科学依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

A549细胞购置于中科院上海细胞库；DMEM培养基、胎牛血清购置于美国GIBIO公司；TGF-β1购置于美国peprotech公司；E-钙黏蛋白、波形蛋白、Snail、GAPDH购置于美国santa cruz公司；siRNA产品购置于广州锐博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 A549细胞用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃，5%CO2孵育箱中培养。实验前无血清同步化24 h，实验分组为(每组n=3)：1)对照组：无血清培养+siRNA阴性对照；2)TGF-β1诱导组：5 ng/mL TGF-β1诱导+siRNA阴性对照；3)转染组：5 ng/mL TGF-β1诱导+SDC2-siRNA 2。按照转染手册步骤进行，每25 cm2细胞培养瓶加入50 nmol/mL lipofectamine 2000和10 μL siRNA阴性对照或SDC2-siRNA。siRNA序列如下：1)SDC2-siRNA 1:CCACGA CGCUGAAUAUACA dTdT;GGUGCUGCGAC UUAUAUGU dTdT;2)SDC2-siRNA:GUUGG UGUAUCGCAUGAGA dTdT;CAACCACA UAGCGUACUCU dTdT;3)SDC2-siRNA 3:GGAGAACGCAAACCAUCCA dTdT;CCUCU UGCGUUUGGUAGGU dTdT.

1.2.2 细胞划痕实验 将A549细胞按照6 000 个/孔种植于24 孔板，次融合后用200 μL枪头划痕，按照实验分组诱导48 h，分别于0、48 h在相同位置拍照，采用IPP6.0图像分析软件测量划痕区域面积，并计算迁移百分比，即(0 h面积-48 h面积)/0 h面积×100%。

1.2.3 明胶酶谱实验 采用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按照20 μg/泳道上样，10%聚丙烯酰胺(含1%明胶)电泳，切胶震荡洗脱，于孵育液(50 mmol/L Tris-HCL、5 mmol/CaCl2、1 μmol/L ZnCl2和0.02% Brij-35)中37 ℃孵育48 h。染色(0.05% 考马斯亮兰R-250、30%甲醇和10%乙酸)3 h，脱色后采用凝胶图像分析系统分析各条带灰度值。

1.2.4 免疫印迹 采用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按照20 μg/泳道上样，13%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜；E-钙黏蛋白、波形蛋白、Snail、GAPDH一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，二抗(1∶3 000)37 ℃孵育45 min，ECL发光。采用IPP6.0图像分析软件测定条带光密度值，以相应内参(GAPDH)的比值作为该蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 筛选有效的SDC2-siRNA

免疫印迹结果显示，siRNA阴性对照组SDC含量为0.89±0.10，SDC2-siRNA 1、SDC2-siRNA 2、SDC2-siRNA 3 SDC2的含量分别为0.42±0.19、0.39±0.11、0.21±0.07。与阴性对照组比较差异均有统计学意义(F=17.386，P=0.001；P=0.001；P<0.001)(图1)。其中SDC2-siRNA3沉默效果最好，因此选择其进行后续实验。

图1 SDC-siRNA有效序列筛选

2.2 SDC2基因沉默抑制TGF-β1介导的A549细胞迁移

与对照组迁移百分比为(9.33±2.08)%比较，TGF-β1诱导组的迁移百分比为(45.67±8.33)%，差异有统计学意义(F=34.270，P<0.001)；与TGF-β1诱导组比较，SDC2-siRNA组迁移百分比为(21.33±4.04)%，差异有统计学意义(P=0.036)。

2.3 SDC2基因沉默抑制TGF-β1介导的A549细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)2活性

对照组活性MMP2灰度值为31.00±4.00，TGF-β1诱导组为96.33±13.50，两组差异有统计学意义(F=45.002，P<0.001)；与TGF-β1诱导组比较，SDC2-siRNA组为59.33±4.04，差异有统计学意义(P=0.006)(图2)。

图2 SDC2-siRNA能够抑制TGF-β1诱导MMP2活性的上调

2.4 SDC基因沉默抑制TGF-β1介导的A549细胞

与对照组比较，TGF-β1诱导组SDC蛋白表达上调，差异有统计学意义(F=24.217，P=0.001)，与TGF-β1诱导组比较，SDC2-siRNA组SDC蛋白表达下调，差异有统计学意义(P=0.002)；与对照组比较，TGF-β1诱导组E-钙黏蛋白表达下调，差异有统计学意义(F=19.232，P=0.001)，与TGF-β1诱导组比较，SDC2-siRNA组E-钙黏蛋白表达上调，差异有统计学意义(P=0.007)；与对照组比较，TGF-β1诱导组波形蛋白表达上调，差异有统计学意义(F=35.919，P<0.001)，与TGF-β1诱导组比较，SDC2-siRNA组波形蛋白表达下调，差异有统计学意义(P=0.001)；与对照组相比较，TGF-β1诱导组Snail蛋白表达上调，差异有统计学意义(F=54.621，P=0.001)，与TGF-β1诱导组比较，SDC2-siRNA组Snail蛋白表达下调，差异有统计学意义(P<0.001)(图3、表1)。

图3 SDC2-siRNA抑制TGF-β1诱导EMT的发生

表1 SDC2基因沉默对E-钙黏蛋白、波形蛋白和Snail蛋白表达的影响

注：与对照组相比较，*P<0.05；与TGF-β1诱导组，#P<0.05

3 讨论

EMT是肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要因素，也是肿瘤干细胞和肿瘤放化疗耐性形成的重要因素[1]。其特征性改变即上皮细胞失去原有表型，其紧密连接蛋白E-钙黏蛋白等表达缺失，同时表达间质细胞标记物(如波形蛋白等)，从而参与了肿瘤的发生与发展[7]。另外，Snail蛋白具有抑制E-钙黏蛋白转录的作用，是促进EMT重要的调控因子之一，其在TGF-β1的诱导下可促进A549细胞发生EMT[8]。在本研究中也发现，经TGF-β1诱导后，A549细胞形态由原有铺路石样转变为成纤维细胞样，且伴有E-钙黏蛋白表达的下调，而波形蛋白、Snail蛋白表达上调，同时伴有细胞迁移能力的提高，以及MMP蛋白活性的上调。

有研究[9]表明，SDC2的异常高表达参与了多种恶性肿瘤的发生与发展。在乳腺癌细胞中，基因沉默SDC2能够诱导乳腺癌细胞发生凋亡，降低乳腺癌移植瘤小鼠模型瘤体体积[10]。其还能通过介导肌动蛋白丝的形成，促进HCT-116结肠癌细胞迁移能力的提高[4]。同时SDC2能够通过上调MMP-7的活性，促进黏着斑激酶和细胞外信号激酶的磷酸化水平，水解HT-29结肠癌细胞E-钙黏蛋白，从而促进了上皮细胞解离和迁移[11]。本研究结果显示，基因沉默SDC2后，能够抑制TGF-β1诱导的E-钙黏蛋白表达的下调，同时降低波形蛋白和Snail蛋白的表达水平，进而抑制了细胞迁移能力和MMP2活性，提示SDC2可能是肺癌靶向治疗的一个候选指标，深入研究SDC2参与肺癌发生、发展的作用机制，有望为临床肺癌诊疗提供一定的科学依据和实验基础。