刘 奕，汪 颀，杜 芹，费 伟△

1.四川省医学科学院·四川省人民医院 口腔科(成都 610072);2.电子科技大学附属医院·四川省人民医院 口腔科(成都 610072);3.中国人民解放军第四五二医院 口腔科(成都 610000)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是人头颈部最常见的恶性肿瘤之一，占全身肿瘤的3%。每年全球有50万新发病例，而其中仅50%的患者生存率>5年。由于OSCC的发生机制仍未明确，临床仍很难把握其发生、发展和预后[1-2]。口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)是一种T细胞介导的口腔黏膜非感染性慢性炎症，世界卫生组织(WHO)将OLP列为一种癌前病变，研究[3-4]表明，OLP患者罹患口腔鳞癌的风险概率比正常人群高约10倍，多在被诊断为OLP后的第6年左右发生癌变。SOX(SRY-related high-mobility-group box)基因是一类重要的转录调控因子，其功能涉及多种早期胚胎发育过程[5-6]。SOX4属于SOX C亚族，表达于细胞核内，SOX4基因的突变、缺失或过表达可导致发育异常或先天性疾病，也与肿瘤的形成和发展密切相关。尽管SOX4在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要作用，但SOX4是否在OLP癌变过程中发挥作用尚不清楚。因此，本实验对转录因子SOX4在OLP和OSCC组织和细胞中的表达进行初步验证，在后续实验中将继续利用RNA干扰技术研究SOX4在OLP癌变过程中对肿瘤细胞的增殖转移是否发挥功能性作用。

1 材料与方法

1.1 病例收集

福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)标本为1997—2007年在美国加州大学洛杉矶分校(University of California,Los Angeles,UCLA)牙学院就诊的30例患者的口腔黏膜组织标本，年龄35～85岁，其中10例为单纯OLP患者标本，10例为来源于OLP的OSCC患者标本，以及10例OSCC患者标本(本实验经UCLA伦理委员会批准完成)。

1.2 免疫组织化学染色(immunochemistry，IHC)

石蜡切片按常规方法进行脱蜡，水合(二甲苯10 min,100% 乙醇3 min,95% 乙醇3 min,70% 乙醇3 min)。抗原修复完成后，将切片置于0.3%过氧化氢-甲醇溶液中作用5 min以消除内源性过氧化物酶活性，10%(v/v)山羊血清封闭切片10 min，滴加一抗SOX4抗体(Abcam,Cambridge,MA,USA)(1∶100稀释)4 ℃孵育过夜。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗抗兔IgG(1∶2 000稀释，GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)，室温孵育2 h。新鲜配制0.04%DAB显色1～5 min，镜下控制反应时间；苏木素复染，脱水，中性树胶封片。

1.3 蛋白提取和质谱分析

分别从OLP、OLP-OSCC、OSCC的FFPE石蜡块中直接提取蛋白，步骤如下：FFPE标本制成10～15 μm的切片，置于Qproteome FFPE Tissue kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)试剂盒脱蜡过夜。在脱蜡水合完成后的沉淀物中加入试剂盒里的EXB缓冲液，按试剂盒推荐步骤提取蛋白。BCA法测量获得蛋白的浓度。肽段的液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)分析使用NanoLC系统(Eksigent Technologies,Dublin,CA,USA)和LTQ 质谱仪(Thermo Fisher,Waltham,MA,USA)，步骤如下：胰蛋白酶(Promega,Madison,WI,USA)对所提取的SOX4蛋白进行溶液内酶解过夜，分离肽段，各馏分烘干，溶解在0.1%TFA中，C18 IntegraFrit色谱柱(New Objective,Woburn,MA,USA)对分离肽段进行浓缩除盐10 min,C18反相毛细管柱(New Objective,Woburn,MA,USA)洗脱，溶解，备用。液相分离流动相的制备：A,5%乙腈/0.1%甲酸(v/v);B,95%乙腈/0.1%甲酸(v/v)。梯度分离流程：5%～15%流动相B中1 min,15%～100%流动相B中40 min,最后在置于100%流动相B中15 min。运行完成后由X-Tandem蛋白质质谱检索软件和Swissprot序列数据库对肽和蛋白质进行鉴定，检索参数设置：质量准确度0.4 Da，允许semi-style cleavage，酶为胰蛋白酶。特有肽段个数为2时视为鉴定成功的蛋白[7]。

1.4 细胞培养

正常人口腔角质形成细胞(normal human oral keratinocytes,NHOK)在EpiLife培养基+人角质形成细胞生长补充剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中培养，舌鳞状细胞癌细胞系(UM1)在DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)+10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+青霉素(100 U/mL)+链霉素(100 U/mL)中培养。培养条件为37 ℃、5%CO2培养箱，细胞90%～95%汇合后经0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.5 SOX4 siRNA转染UM1细胞

1.5.1 实验分组 实验组：转染针对SOX4设计的特异性siRNA的UM1细胞(即：UM1/siRNA细胞)。对照组：转染非特异性siRNA的UM1/siCTRL 细胞(阴性对照)；未处理的UM1(空白对照)。

1.5.2 实验方法 参照LipofectamineTM3000试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)说明书指示：取对数生长期UM1细胞，调整细胞浓度为2×105个/mL，接种至六孔培养板过夜，培养。取双链SOX4 siRNA(sc-38412)和非特异性对照siRNA(均来自Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA,USA)分别与稀释后的转染试剂混合，加入培养基孵育，过夜，更换新鲜的生长培养基，继续培养48 h。

1.6 蛋白免疫印迹分析(western blotting,WB)

WB检测转染前后SOX4在细胞中的蛋白含量。裂解NHOK和转染前后的UM1细胞收集蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性后按25 μg/孔上样，经4%～12% Bis-Tris NuPAGE胶条(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行SDS-PAGE电泳，Trans-blot SD半干转膜仪(Bio-Rad,Brea,CA,USA)将蛋白转移至硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉(Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA,USA)封闭1 h，一抗兔抗人SOX4抗体(Abcam,1∶500稀释)4 ℃孵育过夜，其中β-actin为内参蛋白，TBST润洗3遍，加入HRP标记的二抗抗兔IgG(GE Healthcare,1∶5 000稀释)室温孵育1 h，TBST润洗4遍，ECL试剂盒(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)检测蛋白印迹。

1.7 统计学方法

数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，两两比较采用t检验，检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 SOX4蛋白在OLP、OLP-OSCC和OSCC组织中的表达

IHC结果显示了SOX4在FFPE样本中的表达情况，阳性染色定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色。SOX4在OLP组织中几乎不表达，在OLP-OSCC和OSCC组织中呈阳性表达(图1)。

图1 IHC法检测SOX4在OLP、OLP-OSCC和OSCC组织中的表达注：A、B、C分别为OLP、OLP-OSCC和OSCC组的表达情况。各实验组从上到下，放大倍数分别为×10、20、40倍

2.2 SOX4蛋白的筛选

LC-MS/MS结果显示：分别从OLP、OLP-OSCC和OSCC的FFPE样本中鉴定出了96、142和135种蛋白，其中，有54种蛋白在OLP和OLP-OSCC样本中共同表达，有包含SOX4在内的88种蛋白只在OLP-OSCC样本中表达。只在OLP-OSCC样本中表达，且发挥促肿瘤作用的蛋白见表1。

表1 只在OLP-OSCC中表达的促肿瘤蛋白

2.3 SOX4在细胞中的蛋白表达水平

转染前WB检测结果显示，SOX4蛋白在UM1细胞中的表达高于NHOK细胞，与IHC所示结果一致。以NHOK细胞中SOX4蛋白的相对表达量(设为1)为对照，在UM1细胞中为2.7，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2A)。UM1细胞被成功转染siSOX4，WB检测结果显示，转染后SOX4蛋白在UM1细胞中的表达低于对照组siCTRL在UM1中的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2B)。

图2 WB检测稳定转染siSOX4的UM1细胞中SOX4的表达

3 讨论

在蛋白组学的研究中，蛋白组的质量对于鉴定及验证工作至关重要。从存放时间10年的FFPE组织样本中提取蛋白较困难，课题组在预实验中首先使用同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ技术)结合LC-MS/MS进行FFPE样本的差异蛋白质组学的研究，然而在进行同位素标记多肽时未获得成功，原因可能是由于FFPE样本中的甲醛导致了分子间和分子内的交联，阻碍了蛋白质的溶解。因此，课题组决定采用LC-MS/MS技术直接从FFPE样本中抽提蛋白，分别从OLP、OLP-OSCC和OSCC的FFPE样本中鉴定出了96、142和135种蛋白，然而未能获取更多的蛋白，可能是由于甲醛导致的交联改变了蛋白质和多肽的分子量，增加了蛋白质提取工作的难度。在我们鉴定出的88种只在OLP-OSCC中表达的蛋白中，有10种蛋白可促进肿瘤的发生发展(表1)，这些差异蛋白多为参与物质代谢及和生物转化有关的酶类及结构蛋白，它们广泛参与癌发生发展的病理过程，可能与OSCC发生密切相关。在这些差异蛋白中，SOX4被认为与肿瘤的形成和发展密切相关，但其是否与OLP和OLP癌变相关未见报道。进一步研究这些促肿瘤蛋白对OSCC早期诊断具有潜在的临床意义。

尽管WHO将OLP列为癌前病变，此举仍然存在较大争议。近年来的研究[8-10]表明，OLP的癌变率范围为0%～12.5%，造成如此大的差异的一个重要原因是对OLP的临床诊断标准不同或者病案追踪时间不同。一项Meta分析发现，1988-2008年11 225例OLP患者中有183例患者(1.63%)发生了口腔癌，且大多在被诊断为OLP后的第6年左右发生癌变[4]。研究[3,11-12]认为，癌变可能与一系列源自炎性浸润的分子刺激存在依赖性或相关性，OLP基底细胞受到强烈的淋巴细胞的攻击发生突变，但上皮细胞几乎不发生凋亡。在长期慢性的炎症浸润过程中，OLP基底细胞显著增殖，这可能是OLP发生癌变的一个重要原因。

SOX基因是指具有一个HMG-box基序保守区，且编码的蛋白质SRY/Sry(sex-determining region of Y chromosome)基因产物在该保守区具有60%以上氨基酸序列相似性的基因，可与DNA 序列特异结合，是一类重要的转录调控因子[5-6]。在乳腺癌的疾病进展中，SOX4作为上皮细胞间质转型(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的主要调节因子，可直接调控乳腺癌中的表观遗传修饰分子EZH2和致癌基因HER2/neu(c-ErbB2)的表达[13-14]。在OSCC中，不管原发灶的分化程度如何，SOX4在低分化OSCC以及鳞癌转移灶中都呈过表达[15]。SOX4 siRNA能抑制LNCaP细胞中SOX4的过表达，诱发LNCaP前列腺细胞凋亡，且该效应能通过SOX4的过表达发生逆转，推测SOX4可能成为前列腺癌的新治疗靶点[16]。除此之外，研究[17-20]发现，SOX4在其他实体肿瘤中可发挥促癌作用。然而，也有研究[21]发现，SOX4可能是黑色素瘤的抑制基因，其表达在转移性黑色素瘤中明显降低，敲除SOX4基因后，黑色素瘤细胞迁移和侵袭能力增强。以往研究均表明，SOX4基因在多种肿瘤组织中呈异常表达，与肿瘤的发生、发展及转移密切相关，但对SOX4基因在不同类型肿瘤中的具体作用机制研究未得到统一结论，作为转录因子，SOX4在基因表达复杂的调节网络中，其功能也许不是单一的，肿瘤的类别、分级以及SOX4蛋白与其他调节蛋白的相互作用等因素共同决定着该基因在肿瘤中的确切作用[22]。

课题组在SOX4的表达验证实验中发现，相比OLP、SOX4蛋白在OLP-OSCC和OSCC样本以及口腔鳞癌细胞UM1中表达升高，在SOX4基因敲减后，在UM1细胞中SOX4表达降低。此外，课题组正在进一步研究SOX4基因敲减后，UM1细胞体外和体内的生长变化，以及SOX4对炎症相关肿瘤启动子信号通路在OLP癌变过程中的影响机制研究，以期通过了解OLP癌变的具体机制，探索口腔黏膜慢性炎症转化为口腔鳞癌的内在机制。