章淑艳 倪德胜 王维戚

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)具有自我更新和多向分化特性以及很强的免疫调控功能，在组织工程和再生医学以及多种疾病的细胞治疗领域具有很好的应用前景[1-2]。然而，长期体外培养会引起BMMSCs的功能改变，如表面标志表达降低，增殖能力减低以及分化异常等，影响了BMMSCs的应用[3-5]。因此，如何改善长期体外培养BMMSCs的功能是目前再生医学和细胞治疗领域十分关注的问题。

二甲双胍(metfomin, Met)作为一种重要的糖尿病治疗药物，可以促进骨质疏松模型的骨量恢复[6]。氧化应激是衰老、骨质疏松、糖尿病等病理条件下BMMSCs功能受损的重要因素[7]。近年来的研究表明Met具有抵抗氧化应激的能力[8]。本研究旨在探讨Met能否改善体外长期培养过程中BMMSCs的增殖和成骨分化功能，及其与调控细胞氧化应激水平的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 12 周龄雌性C57小鼠(佳木斯大学动物实验中心)。

1.1.2 主要试剂 主要试剂 α-MEM液体培养基和胎牛血清(Invitrogen, 美国)； Met、 茜素红(Sigma， 美国)； 0.25%胰蛋白酶(MPB iomedicals，美国)； 细胞增殖与毒性检测试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司)； BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(上海碧云天生物技术公司)； 结晶紫(Amresco，美国)； GENMED细胞内氧化应激活性氧(ROS)初级荧光测定试剂盒(GenMed， 美国)； TrizolReagent、 RT-PCR试剂盒(Takara，日本)； PCR引物由上海生工生物工程有限公司根据设计合成。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs分离培养 小鼠处死后置于75%酒精中5 min，取股骨及胫骨放于20%胎牛血清的α-MEM培养液的培养皿， 1 ml注射器将骨髓冲出，收集到离心管，吹散后均匀接种于塑料培养皿中， 37 ℃、 5% CO2孵箱中培养。待细胞融合达到80%左右，胰酶消化传代。选取P1代和P6代的细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞增殖实验 MMSCs按照1×103/孔的密度接种于96 孔板，每孔接种200 μl培养液，检测时每孔加入20 μl CCK-8，孵箱避光孵育2 h后， 酶标仪读取450 nm的吸光度值。连续检测7 天，第0 天的吸光度值作为基准，取每1 d的吸光度值与其的比值绘制生长曲线。根据药物浓度设为3 组，每孔加入10 μl Met，浓度分别为10、 100、1 000 nmol/L。

1.2.3 克隆形成实验 BMMSCs消化计数后，按照1×104/皿的密度接种， 37 ℃， 5% CO2孵箱培养， 每4 d换液， 14 d时去除培养液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定后，0.2%结晶紫染液进行染色，后PBS清洗，拍照。

1.2.4 成骨分化 BMMSCs消化计数后，按照2×105/孔的密度接种于12孔板，待细胞融合到80%左右更换成成骨诱导液，每3 d换液，诱导7 d后进行ALP染色， 14 d后进行茜素红染色。

1.2.5 ALP染色 成骨诱导7 d后，去除诱导液，PBS清洗，加入配置好的ALP染色试剂，避光染色5～30 min，PBS清洗，拍照并使用Image J测定灰度值。

1.2.6 茜素红染色 成骨诱导14 d后，去除诱导液，PBS清洗，异丙醇进行固定，0.1%茜素红染液进行染色，PBS清洗，拍照并通过十六烷基丙磺酸钠溶解后检测吸光度值进行定量。

1.2.7 ROS检测 BMMSCs按照4×105/孔的密度接种于6 孔板，待细胞铺满率达到70%，使用ROS初级荧光测定试剂盒进行检测，倒置显微镜观察。

1.2.8 RT-PCR检测 应用Trizol提取各组细胞的总RNA进行浓度测定，反转录成cDNA，再以cDNA为模板在相应基因的引物作用下进行扩增，使用ABI7500 RT-PCR仪(ABI公司， 美国)进行检测。引物序列见表 1。

1.3 数据处理

表 1 RT-PCR引物序列

2 结 果

2.1 P1和P6代BMMSCs增殖和成骨分化能力比较

P6代BMMSCs的生长曲线明显低于P1代细胞(P<0.05)(图 1A)，表明P6代BMMSCs的增殖能力较低。克隆形成实验(图 1B、 1C)说明P6代BMMSCs的克隆形成能力低于P1代细胞(P<0.05)。PCR结果(图 1H、1I)显示P6代BMMSCs的增殖相关基因Ccnd1和Ccne1表达水平显著低于P1代细胞(P<0.05)。

成骨分化诱导后的ALP(图 1D、 1E)和茜素红染色(图 1F、1G)结果表明，P6代BMMSCs的成骨分化能力明显低于P1代细胞(P<0.05)。PCR结果(图 1J、 1K)表明与P1代细胞相比，P6代BMMSCs的成骨相关基因OCN和Runx2的表达水平较低(P<0.05)。

图 1 P1和P6代小鼠BMMSCs的增殖，克隆形成和成骨分化能力比较

2.2 Met对P6代BMMSCs增殖能力的影响

从生长曲线(图 2A)中可以看到，Met处理可以提高P6代BMMSCs的增殖能力，其中100 nmol/L浓度的提高作用最明显(图 2B、 2C)。100 nmol/L的Met可以显著提高P6代BMMSCs的克隆形成能力(P<0.05)。图 2D、 2E显示Met处理可以增强P6代BMMSCs的增殖相关基因Ccnd1和Ccne1的表达水平(P<0.05)。

2.3 Met对P6代BMMSCs成骨分化能力的影响

ALP染色(图 3A、 3B)和茜素红染色(图 3C、 3D)结果表明100 nmol/L Met提高了P6代BMMSCs的成骨分化能力(P<0.05)，PCR结果表明(图 3E、 3F)Met可以提高P6代BMMSCs成骨相关基因OCN和Runx2的表达水平(P<0.05)。

2.4 Met对P6代BMMSCs氧化应激和抗氧化能力的影响

ROS染色(图 4A，4B)显示P6代BMMSCs相对于P1代BMMSCs，ROS含量明显升高，Met处理可以有效减少ROS的产生(P<0.05)。抗氧化相关基因Foxo1，Foxo3，Sod1和Sod2的PCR结果(图 4C～4F)表明与P1代BMMSCs相比，P6代BMMSCs的抗氧化相关基因表达明显降低，Met处理可以部分恢复其表达水平(P<0.05)。

2.5 Met对P6代BMMSCs干细胞属性(干性)和衰老的影响

图 2 Met对P6代小鼠BMMSCs增殖能力的作用

图 3 Met对P6代小鼠BMMSCs成骨分化功能的作用

PCR技术检测结果表明P6代BMMSCs相对于P1代BMMSCs，干性相关基因Nanog、 Sox2、 C-myc和Klf4的表达水平明显降低，Met处理可以显著增加这些基因的表达水平(P<0.05)(图 5A～5D)。P6代BMMSCs的衰老相关标志基因p16和p53表达增高，且可以被Met降低(P<0.05)(图 5E～5F)。

3 讨 论

Met具有促进BMMSCs成骨分化的功能[9]，并且具有减轻高血糖引起的氧化应激对BMMSCs损伤的作用[10]。本研究中，首先验证了体外长期培养过程中小鼠来源BMMSCs的增殖和成骨分化功能降低。我们将不同浓度Met加入培养体系中，发现Met可以增强P6代BMMSCs的增殖能力，且100 nmol/L的效果较50 nmol/L和1 000 nmol/L更明显。进一步研究发现，Met可以增强P6代BMMSCs的克隆形成能力和成骨分化功能，提示Met可应用于体外培养体系中以改善MSCs功能。

图 4 Met对P6代小鼠BMMSCs的氧化应激和抗氧化能力的作用

图 5 Met对P6代小鼠BMMSCs的干性和衰老相关基因的作用

Fig 5 The effects of Met on the expression level of stemness and senescence genes of P6 mice BMMSCs

氧化应激是体外长期培养过程中细胞功能受损的重要因素[11]。有研究发现，ROS产生过多引起氧化应激，损害BMMSCs的增殖和成骨功能，促进细胞衰老[12]； 降低细胞的氧化应激水平，可以改善BMMSCs功能[13]。本研究发现Met可以降低长期体外培养BMMSCs的氧化应激水平，提高抗氧化相关基因的表达水平，提示抑制氧化应激可能是Met改善长期培养BMMSCs增殖和成骨分化能力的一种机制； 进一步检测干性相关标志物的表达水平，发现Met可以促进相关基因的表达水平，提示Met可能对体外长期培养过程中BMMSCs的干性维持具有有利作用； 进一步研究还发现Met可以降低体外长期培养BMMSCs中衰老相关标志基因的表达水平。

综上所述，Met可以有效改善体外长期培养小鼠来源BMMSCs的增殖和成骨分化功能，提示可以将其作为优化细胞培养体系的手段，以促进BMMSCs的体外扩增和临床应用。