苟晓琴 伍小雪 石 渝 张 柯 黄俊琼

(1 遵义医科大学附属医院检验科，贵州省遵义市 563000，电子邮箱：463997193@qq.com；2 重庆市垫江县人民医院检验科，垫江县 408300)

根据核蛋白和基质蛋白的抗原性不同可将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四型[1]。甲型流感病毒遗传物质为单股负链RNA，编码的蛋白质主要包括血凝素、神经氨酸酶(neuraminidase，NA)、M1、M2、NP、RNA聚合酶、非结构蛋白[2]。根据血凝素和NA的不同，可将甲型流感病毒分为不同的亚型，目前有18种血凝素亚型(H1～H18)和11种NA亚型(N1～N11)[3]。在传播过程中，流感病毒易发生频繁且不可预测的突变，从而使其具有新的致病性和抗原性。目前广谱流感疫苗的研发主要基于血凝素、M2、NP靶抗原，其中以血凝素最为常见[4-6]。基于血凝素的流感疫苗包括蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、重组痘病毒载体疫苗、重组杆状病毒载体疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒疫苗[7]。

2013年，中国出现高致病性的H7N9流感病毒，其引起的临床症状以急性肺炎及急性呼吸窘迫综合征为主，至今已发生5次大流行，致死率达39%[8]。H7亚型流感病毒种类繁多，而特异性疫苗的生产需4～6个月[9]，在疫苗生产过程中流感病毒可不断发生基因突变和基因重组，因此特异性疫苗与原流行株的匹配度可能会大大地降低。相关研究结果表明，H7N1流感疫苗与H7N9、H7N7、H7N3等亚型病毒间均有较强的交叉反应[10]。虽然H7亚型流感疫苗间有交叉保护性，但其免疫效果尚不确定，且各研究结果不尽相同。为进一步明确H7亚型流感疫苗的交叉反应情况，本研究对有关H7亚型流感疫苗交叉反应的研究进行了系统评价，以期为H7亚型流感病毒的防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 文献检索策略 计算机检索PubMed、Cochrane Library、EMbase、Medline、中国生物医学文献服务系统和万方等数据库，并手工检索文献中的参考文献和相应的专业期刊。中文检索词为“H7N1”“H7N2”“H7N3”“H7N4”“H7N5”“H7N6”“H7N7”“H7N8”“H7N9”“H7N10”“H7N11”“H7亚型”“疫苗”；英文检索词为“influenza A Virus”“H7N1”“H7N2”“H7N3”“H7N4”“H7N5”“H7N6”“H7N7”“H7N8”“H7N9”“H7N10”“H7N11”“H7 Subtype”“Vaccines”“H7N1～H7N11”“H7 Subtype”“vaccine”。检索时间均为建库至2018年3月7日。

1.2 纳入标准 (1)研究对象：健康人群(指无肿瘤、感染、免疫缺陷及自身免疫病等影响免疫功能疾病者)[11]，且有H7亚型流感疫苗交叉反应的描述，不限国籍、种族、年龄。(2)干预措施：接种H7亚型流感疫苗，以接种安慰剂为对照措施或进行前后自身对照。(3)结局指标：流感感染率、流感样症状发生情况。采用血凝素抑制试验(hemagglutinin inhibition test，HI)、微量中和试验(microneutralization test，MN)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等血清学试验检测疫苗接种前后交叉反应性抗体的血清学变化，指标包括抗体血清转换率(seroconversion rate，SCR)、血清保护率(seroprotection rate，SPR)、几何平均滴度(geometric mean titer，GMT)、平均几何增长(mean geometric increase，MGI)等。其中，SCR指接种前抗体血清滴度≤1 ∶10，接种后抗体血清滴度≥1 ∶40，或接种前抗体血清滴度≥1 ∶10，接种后抗体血清滴度呈4倍增长的受试者例数占总人数的百分比；SPR为接种后抗体血清滴度≥1 ∶40的受试者例数占总人数的百分比；MGI为接种前后血清抗体GMT之比。(4)研究设计：随机对照试验(randomized controlled trial,RCT)或非随机对照的临床试验。

1.3 排除标准 (1)孕妇或哺乳期妇女，接种过影响H7亚型流感疫苗交叉反应的疫苗者；(2)动物实验研究；(3)与疫苗交叉反应无关、重复、信息不全、观点性或者评论性文章。

1.4 文献筛选及资料提取 由两名评判员结合纳入与排除标准，通过阅读标题、摘要和全文的方式逐步进行文献的判读，交叉核对结果；若存在分歧，通过协商或与第3名研究人员讨论解决。对最终纳入研究的文献进行数据提取，内容包括第一作者及发表时间、国家、样本量、年龄、疫苗剂量、有无佐剂及佐剂类型、接种剂数及间隔时间、结局指标、疫苗株、交叉反应株等；采用Excel 2010表格提取和计算数据；若存在数据的缺失，与原文作者联系获取相关资料。

1.5 质量评价 采用Cochrane风险偏倚评估工具对纳入文献进行方法学质量评估。内容包括：随机序列产生是否正确，是否实现分配隐藏，是否对研究者和受试者实施盲法，是否对研究结果盲法评价，结果数据是否完整，是否存在选择性报告研究结果，是否存在其他偏倚风险。以“低风险”“高风险”“不确定”3个等级进行评价。

1.6 统计学分析 采用RevMan 5.3软件进行Meta分析，并绘制森林图。二分类变量采用相对危险度(related risk，RR)、危险度差值(risk difference，RD)及其95%CI估计合并效应量。通过χ2检验及I2值评估纳入研究的统计异质性，当P>0.10且I2<50%时，表明各研究间无统计学异质性，采用固定效应模型合并效应量；当P≤0.10或I2≥50%时，表明各研究间存在统计学异质性，则进一步分析异质性来源，采用亚组分析或敏感性分析等方法处理，在排除明显临床异质性影响后，采用随机效应模型合并效应量。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 纳入文献的基本特征与方法学质量评价 初检获得相关文献1 345篇，逐层筛选后最终纳入5篇文献[11-15]，均为英文文献。共纳入722名受试者，其中4篇为RCT[11-14]，1篇为非随机对照临床试验(未提及是否为RCT)[15]。所纳入文献中，交叉反应的结局指标均未提到流感感染率、疫苗保护率和流感样症状，因此本研究仅从血清学抗体水平(SCR、SPR)对交叉反应进行评估。文献[12-13，15]报告了H7N1疫苗对H7N9、H7N3毒株的交叉反应，文献[14]报告了H7N3疫苗对H7N9毒株的交叉反应，文献[11]报告了H7N9疫苗对H7N1毒株的交叉反应。文献[14]仅测定了接种1剂和2剂后的SCR，文献[15]仅测定了接种2剂后的SPR。纳入文献的基本特征见表1。文献质量评价结果显示，除了文献[14]的分配隐藏为高风险，其余各项目均为低风险或不清楚，说明纳入文献的总体质量尚可。见表2。

表1 纳入研究的基本特征

注：alum：铝佐剂；fold induction为接种前后抗体几何平均滴度之比。

表2 纳入研究的质量评价

注：L：低风险；H：高风险；U：风险不确定。

2.2 Meta分析结果

2.2.1 不同接种剂数对H7亚型流感病毒疫苗免疫效果的影响：共4篇文献[11-14]分析了接种1剂及两剂疫苗受试者的SCR，各研究间异质性均有统计学意义(I2=75%,P=0.007；I2=73%,P=0.01)，采用随机效应模型分析，结果显示，接种1剂疫苗受试者的SCR为0.19(95%CI：0.13～0.25；P<0.001)，接种两剂疫苗受试者的SCR为0.76(95%CI：0.70～0.83，P<0.001)，见图1。4篇文献均比较了两种接种剂数的免疫效果，各研究间异质性均有统计学意义(I2=80%,P=0.002)，采用随机效应模型分析，结果显示，接种两剂疫苗的SCR优于接种1剂疫苗(RR=3.83,95%CI：2.63～5.57；P<0.001)，见图2。

共3篇文献[11-13]分析接种1剂疫苗受试者的SPR，各研究间异质性均有统计学意义(I2=83%,P=0.003)，采用随机效应模型分析，结果显示，接种1剂疫苗受试者的SPR为0.19(95%CI：0.12～0.26；P<0.001)。共4篇文献[11-13，15]分析接种两剂疫苗受试者的SPR，各研究间异质性均有统计学意义(I2=0%,P=0.42)，采用随机效应模型分析，结果显示，接种两剂疫苗受试者的SPR为0.80(95%CI：0.77～0.83；P<0.001)，见图1。共3篇文献[11-13]比较了两种接种剂数的免疫效果，各研究间异质性均有统计学意义(I2=79%,P=0.009)，采用随机效应模型分析，结果显示，接种两剂疫苗的SPR优于接种1剂疫苗(RR=4.20，95%CI：3.02～5.82；P<0.001)，见图2。

图1 不同接种剂数免疫效果的森林图

图2 比较接种1剂疫苗和接种两剂疫苗SCR、SPR的森林图

2.2.2 H7亚型流感病毒疫苗与H7亚型流感病毒间的交叉反应：上述分析结果显示，接种2剂后受试者免疫效果最好，故在此条件下分析交叉反应水平。共4篇文献[11-14]分析H7亚型流感病毒与疫苗间交叉反应的SCR，各研究间异质性均有统计学差异(P<0.001，I2=97%)，采用随机效应模型进行分析，结果显示，交叉反应的SCR为0.65(95%CI：0.42～0.87，P<0.001)。共4篇文献[11-13,15]分析H7亚型流感病毒与疫苗间交叉反应的SPR，各研究间异质性均有统计学差异(P<0.001，I2=98%)，采用随机效应模型进行分析，结果显示，交叉反应的SPR为0.71(95%CI：0.44～0.98，P<0.001)。见图2。文献[12]纳入的研究对象均为老年人，去除该文献后发现异质性并未明显降低，说明该篇文献不是异质性来源；逐一剔除各篇文献进行敏感性分析，研究间的异质性并未降低，考虑疫苗的剂量及佐剂等因素是异质性的主要来源。

图3 H7亚型流感病毒疫苗与H7亚型流感病毒间的交叉反应

2.2.3 H7亚型流感病毒疫苗与H7N9毒株间的交叉反应：共3篇文献[12-14]分析该交叉反应的SCR，各研究间异质性有统计学差异(P<0.001，I2=97%)，采用随机效应模型进行分析,结果显示，交叉反应的SCR为0.66(95%CI：0.40～0.93，P<0.001)。共3篇文献[12-13,15]分析该交叉反应的SPR，各研究间异质性有统计学差异(P<0.001，I2=97%)，采用随机效应模型进行分析，结果显示，交叉反应的SPR为0.74(95%CI：0.48～1.00，P<0.001)。见图2。

图4 H7亚型流感疫苗与H7N9毒株间的交叉反应

3 讨 论

目前流感的预防措施主要以接种季节性流感疫苗的方式为主，但有研究结果显示，季节性流感疫苗与H7N9流感病毒之间不存在交叉反应[16]，且H7亚型流感病毒种类众多，下一次大流行的H7亚型流感病毒何时出现，其能否与季节性流感疫苗发生交叉反应也不得而知。特异性疫苗的生产通常需4～6个月[9]，当某一新型H7亚型流感病毒出现时，生产特异性疫苗这一方法已来不及对该病毒起到防控作用，且病毒易突变，4～6个月后生产的特异性疫苗与原流行株的匹配度也可能会大大地降低。因此，近年来的研究焦点转向流感病毒免疫的交叉反应，如Madan等[11-13]研究发现，H7N1疫苗与H7N9流感病毒的交叉反应、H7N9疫苗与H7N1流感病毒间的交叉反应均较好。

血凝素是位于流感病毒表面的蛋白，是刺激产生保护性抗体的最主要抗原。血凝素抗原性相似程度越高，所引起的交叉反应越强[17]。同一血凝素亚型流感疫苗具有相似的抗原表位，可与相同血凝素分型的其他亚型流感病毒产生交叉保护作用。系统进化分析结果显示，不同H7亚型病毒间的血凝素基因序列具有高度同源性[18]。特异性免疫效果可影响疫苗与病毒间的交叉反应，故本研究在分析交叉反应前，先确定接种H7亚型流感疫苗后受试者体内特异性免疫效果最优的接种条件。结果显示，接种两剂疫苗的免疫效果最好(P<0.05)，此时SCR和SPR均可达到欧洲人类医药产品指导委员会和美国生物制品评价与研究中心的疫苗生产许可标准[16,19-20]。因此，本研究选择在接种第2剂疫苗后对H7亚型流感病毒疫苗的交叉反应进行评估。结果显示，H7亚型流感病毒疫苗与H7亚型流感病毒间交叉反应的SCR为0.65，SPR为0.71，提示H7亚型流感病毒疫苗对H7亚型流感病毒的免疫效果较好。逐一剔除各篇文献进行敏感性分析，发现各研究间的异质性并未降低行，考虑疫苗剂量以及佐剂是异质性的主要来源；但由于纳入研究的文献数量较少，未能进行亚组分析。由于H7N9毒株是目前引起的H7亚型流感病毒发病率最高、病情最为严重，本研究还分析了H7亚型流感疫苗与H7N9毒株间的交叉反应。结果显示，H7亚型流感疫苗可对H7N9毒株产生交叉保护作用(SCR为66%，SPR为74%)，与Rudenko等[21]的研究结论相似。

本研究也存在局限性：首先，纳入的研究只有美国和加拿大两个国家，不能排除存在地域的偏倚。其次，受文章数量的影响，我们未能对H7亚型疫苗进行不同的剂量、有无佐剂、具体株间的亚组分析。

综上所述，H7亚型流感病毒与其疫苗间存在交叉反应性。这提示若某一特异H7亚型流感暴发，在尚无特异性疫苗时，可通过接种其他H7亚型疫苗的方式进行防治，但结果尚需高质量、大规模的RCT进一步验证。