郭 辉 魏斐斐 蒋群湘 谢裕安

(1 广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部，南宁市 530021，电子邮箱：guohui6222@163.com；2 广西桂林市人民医院放疗科，桂林市 541002；3 广西柳州市人民医院放疗科，柳州市 545006)

在我国，原发性肝细胞癌(下称“肝癌”)的发病率和死亡率分别高居恶性肿瘤的第四位和第二位[1]，极大威胁着居民的生命健康。广西扶绥县是我国肝癌高发地区之一，具有明显的家族聚集性[2]。肝癌的发生发展在很大程度上与个体间基因型的遗传多态性密切相关。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)作为第三代遗传标记，有助于解释不同群体或个体对肿瘤易感性的差异[3]。甘露聚糖结合凝集素关联丝氨酸蛋白酶(mannan-binding lectin-associated serine protease,MASP)1基因位于染色体3q27-3q28，含有18个外显子，其可通过前mRNA剪切编码3种蛋白质，即MASP1、MASP3、甘露聚糖结合凝集素相关蛋白44(mannan-binding lectin-associated protein 44,MAp44)[4]。其中，MASP1是补体激活途径的重要组成部分，可影响机体免疫反应，与多种疾病的发生显著相关[5]。因此，本研究以MASP1基因rs3774268和rs17040位点作为研究靶点，利用质谱技术对广西扶绥县壮族肝癌家系及正常家系的基因位点进行检测，探讨MASP1基因多态性与肝癌遗传易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 在广西扶绥县采集20个肝癌高发家系，由20例肝癌患者(肝癌组)，以及59例与患者有血缘关系的直系健康亲属(非肝癌组)组成。纳入标准：肝癌高发家系成员均为广西扶绥县常住(全年在家居住6个月以上)壮族人群(三代以内均为壮族人群)；肝癌高发家系非肝癌组为与肝癌患者有直接血缘关系且未患肝癌的一级亲属(包括父母、子女、兄弟姐妹)和二级亲属(包括叔伯、堂兄弟姐妹)。肝癌组患者于2003年1月至2011年11月在广西医科大学附属肿瘤医院接受外科治疗，术后经组织病理学确诊为肝癌，且术前未行化疗、放疗或生物治疗等；男17例,女3例；年龄28～65岁,中位年龄45岁；HbsAg(+)19例,HbsAg(-)1例；甲胎蛋白(+)13例,甲胎蛋白(-)7例；吸烟5例,不吸烟15例；饮酒2例,不饮酒18例。非肝癌组中，男28例,女31例；年龄16～86岁,中位年龄42岁； HbsAg(+)31例,HbsAg(-)28例；甲胎蛋白(+)1例,甲胎蛋白(-)58例；吸烟12例,不吸烟47例；饮酒12例,不饮酒47例。选择与肝癌高发家系无血缘关系的40例扶绥县居民为正常对照组。纳入标准：与肝癌高发家系无血缘关系的扶绥县人群(三代以内居住在扶绥县)，且无肝炎病史、肿瘤病史及遗传病史。正常对照组中，男26例,女14例；年龄16～85岁,中位年龄47岁；吸烟15例,不吸烟25例；饮酒17例,不饮酒23例。3组间性别、年龄比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究根据国家人类基因组研究伦理准则进行，所有选定者均签署相关知情同意书。

1.2 相关定义 (1)吸烟：近期或以往吸卷烟100支或烟丝100 g以上；(2)饮酒：近期或以往每周饮酒至少1次,每次折合纯酒精量>40 g,连续饮半年以上。

1.3 MASP1基因型分析

1.3.1 主要试剂及仪器：血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购自北京天根生物公司。Gold Reagent Kit试剂盒、MassARRAY Assay Designer 3.1软件、MassARRAY Samsung Nanodispenser RS 1 000 nL点样仪、MassARRAY Analyzer Compact质谱系统均购自美国Sequenom公司。质谱仪微阵列芯片SpectroChip、热启动Taq酶均购自美国Agena Bioscience公司。

1.3.2 DNA提取：采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取肝癌组癌组织样本、非肝癌组及正常对照组静脉血液(无须空腹)样本的DNA。严格按照试剂盒说明书进行操作，提取后用分光光度计测定DNA的纯度(A值为1.7～2.1)，置于-80℃冰箱保存备用。

1.3.3 引物设计与合成：采用MassARRAY Assay Designer 3.1软件设计引物，各SNP位点均需要一条延伸引物和两条PCR扩增引物，引物序列见表1。PCR扩增引物、单碱基延伸引物由深圳华大基因公司合成。

表1 引物序列

1.3.4 PCR扩增、引物延伸及芯片点样：使用热启动Taq酶和引物常规扩增靶片段(40个循环)。在上述PCR产物中加入2 μL碱性酸化酶消化，以除去多余的脱氧核糖核苷三磷酸，消化程序：37℃ 60 min；85℃ 10 min。然后根据延伸反应程序执行单碱基延伸，并通过树脂脱盐纯化产物。最后使用点样仪将纯化后的产物在质谱仪微阵列芯片SpectroChip上点样。

1.3.5 检测SNP位点：使用Mass ARRAY Analyzer Compact质谱系统实验平台对MASP1基因进行SNP分型，将已点好样的SpectroChip放入质谱仪进行自动化检测。检测完成后用TYPER 4.0软件分析实验结果，获得分型数据。通过引物延伸反应获得的产物质谱峰的位置确定其分子质量以获得分型结果。在质谱图上，1种颜色可以对应2个或3个峰值，为SNP位点的延伸引物峰及两个等位基因峰，若该位点属于纯合子，则仅存在1个等位基因峰,若为杂合子，则存在2个等位基因峰。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计数资料以例数(百分比)表示。采用拟合优度χ2检验对各组基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验[6]。采用非条件Logistic回归分析计算各基因型和等位基因人群患肝癌风险的比值比(odds ratio,OR)及95%可信区间(confidence interval，CI)，校正因素为年龄、性别、吸烟、饮酒、HBsAg、甲胎蛋白。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因型检测结果 MASP1基因rs3774268位点存在AA、GG和GA 3种基因型，其中AA基因型6例、GG基因型79例、GA基因型34例。rs17040位点存在CC、CT两种基因型，其中CC基因型101例、CT基因型17例，非肝癌组中有1例未能检测出rs17040位点的基因型。MASP1基因质谱图见图1。

图1 MASP1基因rs3774268位点和rs17040位点质谱图

注：图A、B、C分别是rs3774268位点GG、AA、GA基因型的质谱图；图D、E分别是rs17040位点CC、CT基因型的质谱图。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 结果显示,MASP1基因rs3774268和rs17040位点各基因型频率与期望值吻合度较好(均P>0.05),各组具有人群代表性。见表2。

表2 MASP1基因rs3774268和rs17040位点基因型的Hardy-Weinberg平衡检验结果[n(%)]

2.3 MASP1基因rs3774268和rs17040位点多态性与肝癌易感性的关系 肝癌组与非肝癌组rs3774268和rs17040位点各基因型和等位基因频率比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。肝癌组与正常对照组rs3774268位点的基因型频率、rs17040位点各基因型和等位基因频率比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；而肝癌组rs3774268位点的A等位基因频率高于正常对照组(P<0.05)。Logistic回归分析显示，经年龄、性别、吸烟、饮酒、HBsAg、甲胎蛋白校对后，rs3774268位点的A等位基因与肝癌的发生相关(P<0.05)。见表3及表4。

表3 MASPI基因rs3774268位点多态性与肝癌家系遗传易感性的关系

表4 MASPI基因rs17040位点多态性与肝癌家系遗传易感性的关系

3 讨 论

补体系统是人体固有免疫系统的重要组成部分,可通过一系列丝氨酸蛋白酶的级联酶解反应活化,其活化中间产物最终形成的攻膜复合物可发挥调节吞噬、化学趋化、介导细胞溶解、清除免疫复合物及细胞凋亡等功能[7]。人体可通过3种途径(经典途径、旁路途径和凝集素途径)激活补体系统。MASP1是补体激活途径的重要组成部分，可影响机体免疫反应，与多种疾病的发生相关[4]。MASP1基因可通过前mRNA剪切编码三种蛋白质-MASP1、MASP3、MAp44。MASP1蛋白是由699个氨基酸残基和19个氨基酸残基构成的前导肽，是一种通过快速自激活然后分裂MASP2来触发凝集素途径的酶[8]；MASP3蛋白由728个氨基酸残基(包括19个氨基酸残基)组成，可通过与MASP1或MASP2竞争结合凝集素途径的模式识别分子来负调节补体系统，同时其还具有活化D因子的活性，而D因子是补体旁路途径活化的关键酶[9]； MAp44也可通过与MASP1、MASP2、MASP3竞争结合凝集素途径的模式识别分子来负调节补体系统[10]。研究表明MASP1基因rs3774275位点的多态性与肺结核的发生有显著的相关性[11]；MASP1在神经胶质瘤[12]、原发性平滑肌肉瘤[13]中呈高表达，且血清高MASP1水平与宫颈癌进展和较差的疾病预后明显相关[14]。但目前未见MASP1基因多态性与肝癌关系的相关文献报道，因此，本研究分析了MASP1基因不同位点SNP与肝癌易感性的关系，以期能够找到筛选肝癌高危人群的靶点，并为阐明肝癌发生的分子机制和预防提供实验室依据。

本研究结果显示，在正常人群中，rs3774268位点A等位基因个体罹患肝癌的风险是G等位基因个体的3.75倍(P<0.05)，但rs17040位点不同基因型及等位基因个体间罹患肝癌的风险比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。这提示MASP1基因rs3774268位点携带A等位基因者肝癌发生风险较高，而rs17040位点的SNP与肝癌高发家系遗传易感性间无明显相关性。

综上所述，MASP1基因rs3774268位点的SNP与广西扶绥县壮族人群肝癌高发家系遗传易感性存在关联，而rs17040位点的SNP与广西扶绥县壮族人群肝癌高发家系遗传易感性无关联。由于本研究仅在广西扶绥的壮族人群中进行，且样本量较小，可能存在一定的选择偏倚，之后需扩大样本含量，并在不同地区和不同人群中进行更深入的研究。