严欣茹， 杨尚霖， 郭春华*， 柏 雪， 张正帆， 万国英

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，动物科学国家民委重点实验室，四川成都 610041；2.贵州五新农业科技有限责任公司，贵州铜仁 554300）

杜仲（Eucommia ulmoides oliver）是杜仲科杜仲属的多年生落叶乔木植物，是我国珍贵传统中药材。研究表明，杜仲中含有包括绿原酸、黄酮类、杜仲苷、鞣质、多糖、氨基酸在内的多种营养物质和活性成分（唐瑶等，2014），具有增强免疫力、降低体内脂肪、平衡血压、抗菌消炎、抗应激、健筋骨、清热利尿、抗衰老、抗氧化等多种药理作用（赵滢等，2014）。近年来，由于饲料中添加抗生素和化学药物对畜禽产品品质产生极大的负面影响，杜仲作为抗生素代替物走进人们的视野。研究发现，在日粮中添加杜仲，能够改善动物机体免疫系统的功能，提高机体防御能力，显著促进动物生长，提高饲料利用率，改善肉质，提高风味。目前，杜仲作为饲料添加剂，已经应用于猪、家禽、鱼类及部分反刍动物饲料中（梁松琼等，2015）。

近年来，为提高牦牛生产效率，研究出放牧加补饲或者舍饲育肥模式（陈光吉等，2015），而杜仲在牦牛饲料中应用效果鲜见报道。本试验通过体外模拟瘤胃内环境，进行体外产气试验，研究杜仲对牦牛瘤胃发酵及养分降解率的影响，为杜仲作为饲料添加剂在牦牛饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 杜仲叶由贵州五新农业科技有限责任公司提供，取材于贵州省铜仁市。杜仲叶置于65℃烘箱烘干，粉碎后过40目筛，用塑料自封袋保存备用。

从西南民族大学青藏高原牦牛试验基地 （位于阿坝州红原县），选取3头体重相近成年健康牦牛，饲喂前用真空泵抽取瘤胃内容物，混合后用4层纱布过滤，封装后迅速带回实验室备用。

1.2 试验设计 采用单因素试验设计，分为6个处理组，基础日粮精粗比为50∶50，分别用0%（对照组）、1%、2%、3%、4%、5%的杜仲叶替代基础日粮中的粗料，每个处理组设4个重复。试验日粮组成及营养水平见表1。

表1 试验日粮组成及营养水平（风干基础）%

1.3 体外发酵 培养液的配制参照Menke（1988）的方法，人工唾液配制见表2。加入1%刃天青数滴，持续通入CO2去除氧气直至缓冲液由红色变成无色为止，现配现用。然后将瘤胃液与人工唾液按1∶2体积比配制成体外混合培养液。将配制好的混合培养液持续通入CO2气体并置于39.5℃的恒温水浴锅中预热备用。体外培养装置为100 mL具塞塑料注射器，内有刻度，注射器前端连接一条5 cm的硅胶软管，并用止水夹将软管夹紧。试验前分别准确称取1000 mg底物置于注射器底部，然后吸入50 mL混合培养液，轻微震荡摇匀并排出气泡后置于（39±0.5）℃的恒温培养箱中培养72 h。每个处理四个重复，并设置一个空白对照管（仅含有混合培养液）以减少系统误差。 分别记录 2、4、6、9、12、24、36、48、72 h各时间点的产气量，每间隔2 h轻微摇匀注射器 （剧烈发酵后会出现固液相分离的现象），每次记录产气量后推动活塞至初始刻度。待培养72 h后，将塑料注射器取出，放入冰水浴中使发酵停止。

表2 人工唾液配制

1.4 指标测定及方法

1.4.1 发酵指标测定 体外培养72 h后立即用冰水浴终止发酵后，将培养液无损的转移至50 mL离心管中，立即用PHB-5型便携式pH计，测定培养液的pH；NH3-N的测定参考冯宗慈等（2010）的比色法；MCP浓度的测定参照Makkar等（1982）的方法。

1.4.2 常规营养成分的测定 饲料原料和培养液固相残留物中CP、DM、Ash、ADF和NDF含量的测定均参照张丽英（2003）的方法。 DMD、CPD、ADFD和NDFD的计算参照马艳艳等（2014）的方法。

1.5 数据统计及方法 产气量/mL=该段时间内培养管产气量-空白管产气量。产气动力学参数的计算参照France等 （2000）提出的计算模型：GP=b×（1-e-c（t-L）），使用 SPSS 18.0 统计软件中非线性回归程序进行产气参数估计。其中GP表示培养t时间点的产气量，mL；e为自然对数；t为培养时间，h；b为潜在最大产气量，mL/g DM；c为产气速率，h；L为产气前的延滞时间，h。添加杜仲叶的处理组与对照组进行单一自由度的方差分析。以P＜0.05为差异显著性判断标准，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 杜仲叶营养成分 实验室测定的杜仲常规营养成分中，DM含量为92.82%，干物质基础上，CP含量为12.15%，EE含量为4.20%，Ash含量为9.71%，NDF含量为45.31%，ADF含量为33.07%。

2.2 体外发酵动力学参数特点 产气参数如表3，体外发酵72 h后，各组总产气量（GP）、最大潜在产气量（b）、产气速率（c）及产气前停滞时间（L）差异均不显著（P＞0.05）。由图1体外产气曲线可以看出，0～24 h产气速率逐渐变大，24 h后速率逐渐放缓，各组总体趋势相同，72 h总产气量均接近或达到最大潜在产气量。

表3 不同添加水平72 h产气量和产气动力学参数

图1 72 h体外产气曲线

2.3 体外发酵DMD、CPD、NDFD和 ADFD的特点 由表4可知，不同添加水平的杜仲叶对DMD、CPD、NDFD和 ADFD有极显著的影响（P＜0.01）。本试验中，随杜仲叶添加水平的提高，日粮中DMD、CPD、ADFD和NDFD呈二次曲线变化（P＜0.01）。如图2、图3所示，与对照组相比，1%组、2%组、3%组、4%组、5%组的 DMD分别 提 高 8.85% 、9.15% 、11.90% 、15.47% 、14.55%，CPD分别提高 2.20%、4.11%、8.59%、10.72%、7.27%，NDFD分别提高 5.11%、7.11%、9.50% 、13.31% 、6.83% ，ADFD 分 别 提 高11.96%、15.17%、16.57%、16.57、18.60%、11.25%。在添加量为4%时达到最大值，添加量提高到5%时，日粮中DMD、CPD、ADFD和NDFD显著降低（P ＜ 0.05）。

表4 不同添加水平72 h发酵后DMD、CPD、NDFD 和 ADFD

图2 不同添加水平72 h发酵后DMD和CPD

图3 不同添加水平72 h发酵后NDFD和ADFD

2.4 体外发酵pH、NH3-N和MCP浓度特点由表5可知，各试验组之间的pH差异均不显著（P ＞ 0.05），变异范围在 6.33～ 6.37，均属于瘤胃微生物生长的正常范围；各试验组的NH3-N和MCP浓度差异极显著（P＜0.01），如图4所示，与对照组相比，1%组、2%组、3%组、4%组、5%组的NH3-N浓度分别降低 4.05%、4.73%、8.68%、11.03%、12.99%，MCP浓度分别提高 104.55%、204.55%、222.73%、236.36%、236.36%。 NH3-N 浓度随杜仲叶添加水平的提高呈线性下降，而MCP浓度随杜仲叶添加水平的提高呈二次曲线变化，添加量为1%～3%时MCP浓度显著增加，当添加量为3%以上时，MCP浓度的增加速率变缓，达到一个平台。

表5 不同添加水平72 h发酵后pH、NH3-N浓度和MCP浓度

图4 不同添加水平72 h发酵NH3-N和MCP浓度

3 讨论

3.1 添加杜仲叶对牦牛瘤胃液体外产气量的影响 产气量是综合评价日粮发酵程度的重要指标，不仅能够体现瘤胃微生物的活跃程度，也能反映日粮蛋白质营养水平，产气量的大小与日粮中有机物的降解程度呈正相关 （黄雅莉，2014）。本试验中，各组发酵72 h后的总产气量差异不显著，但是各试验组的总产气量均值呈先增加后降低趋势，4%组的产气量达到最大值，与本试验中DMD趋势基本一致，各组差异不显著，可能是因为本试验采用的体外发酵装置，只是模拟瘤胃环境，与真实的瘤胃环境还存在一定差异，所以不能显著体现各组产气量的差异。

3.2 添加杜仲叶对牦牛瘤胃液体外DMD、CPD、NDFD 及 ADFD 的 影 响 DMD、CPD、NDFD和ADFD能够反映瘤胃微生物对底物分解程度的强弱（赵慧娟等，2006）。瘤胃微生物对发酵底物的降解程度不仅与微生物活性有关，还与发酵底物的组成有关。本试验中，DMD和CPD显著提高，在添加量为4%时达到最大值后下降，可能是因为随着杜仲叶添加量的增加，供瘤胃微生物发酵利用的碳水化合物和营养物质增加，使体外发酵DMD和CPD呈上升趋势。孟梅娟等（2016）的试验中，NDFD和 ADFD先增加后降低，本试验中，随着杜仲叶添加量的增加，体外发酵72 h后的 NDFD和ADFD先增加后降低，在添加量为4%时达到最大值，可能是杜仲叶的添加，增加了日粮中的可发酵物质，加快微生物对发酵底物的利用，但是当杜仲叶的添加量过大时，体外发酵可能受到抑制，NDFD和ADFD反而下降，因此杜仲叶应该适量添加。

3.3 添加杜仲叶对牦牛瘤胃液体发酵参数pH、NH3-N浓度和MCP浓度的影响 反刍动物对饲料营养物质进行消化吸收主要是通过瘤胃中的微生物发酵，而瘤胃液的pH是评价瘤胃内营养物质发酵和瘤胃稳定的重要指标，其直接反映瘤胃内生态系统的多样性和动物体的健康状况（Nagaraja等，2007）。在正常生理状态下，反刍动物采食后，瘤胃中的pH呈动态变化，先逐渐下降再逐渐升高。李新等（2012）研究表明，反刍动物瘤胃液的pH正常变化范围为5.5～7.5，本试验瘤胃液pH均在6.33～6.46范围内变化，并且随着杜仲叶添加量的增加，无显著变化。刘彩娟等（2011）研究表明，在日粮中添加复合益生菌对瘤胃pH影响不显著；陈亮等（2017）研究植物乳杆菌对玉米秸秆和水稻秸秆体外发酵特性的影响，其结果对瘤胃pH影响不显著，并且认为其对于维持pH的稳定平衡具有积极作用。本试验结果与刘彩娟等（2011）和陈亮等（2017）的结果一致，表明在基础日粮中添加不同水平的杜仲叶对瘤胃pH没有影响。

NH3-N作为反映瘤胃发酵的一个重要指标，主要受日粮中蛋白质水平、瘤胃上皮的吸收作用、瘤胃微生物的合成与利用以及食糜的排空速度等因素的影响。瘤胃中适宜的NH3-N浓度才能保证微生物蛋白的正常合成。研究表明，瘤胃中的NH3-N浓度为6.3～27.5 mg/100 mL时，最适宜微生物发酵 （Murphy等，1987）。本研究中72 h发酵后NH3-N的浓度为35.28～30.69 mg/100 mL，与 Murphy等（1987）研究中的 NH3-N 适宜浓度相比，本研究中的NH3-N浓度相对偏高，可能原因是由于在本试验中采用的体外产气装置是塑料针筒，产生的部分NH3-N无法像在真正的瘤胃一样被瘤胃上皮吸收和随着食糜排出。史仁煌等（2015）研究表明，日粮中添加杜仲素显著降低了瘤胃中的NH3-N浓度。本试验中，NH3-N的浓度随着杜仲添加量的增加显著降低，与史仁煌的研究结果一致，可能原因是杜仲叶中含有多种具有抑菌作用的物质，不同程度的抑制产氨活性较强的专性氨基酸发酵菌的活性，从而降低瘤胃中NH3-N的浓度。

瘤胃中MCP浓度的高低可反映瘤胃微生物利用NH3-N的能力，同时，也可反映瘤胃中微生物种群的数量，MCP可为反刍动物提供蛋白质需要的40%～80%，是主要的氮源提供者。本试验中，瘤胃MCP浓度随日粮中杜仲叶添加量的增加而显著增加，可能是因为杜仲叶中富含多糖类化合物，可为瘤胃微生物提供更多的营养成分，从而促进瘤胃微生物利用NH3-N合成MCP。董金金等（2018）研究表明，日粮中添加酵母多糖，可降低瘤胃液中NH3-N浓度，提高MCP浓度，与本试验结果一致，说明日粮中添加杜仲叶能够促进牦牛瘤胃中有益菌的生长繁殖，提高氮的利用率，合成更多的MCP。

4 小结

日粮中添加杜仲叶对瘤胃体外发酵总产气量、最大潜在产气量、产气速率、产气前停滞时间和pH均没有影响；日粮中添加杜仲叶可显著提高日粮DM、CP、ADF及NDF的降解率，并随添加量的增加呈二次曲线变化，当添加量为4%时，达到最大值；瘤胃液中NH3-N浓度随杜仲叶添加水平的提高呈线性下降，而瘤胃液中MCP浓度随杜仲叶添加水平的提高呈二次曲线变化，添加量为3%时，MCP浓度达到峰值。日粮中杜仲叶适宜添加量为3%～4%。