陈 琛， 王炳彦， 钟兴文， 杨旭艳， 马 丹， 戚 敏，孙照程， 陈 莹， 孔凡虎， 华雪妃， 章雨竹， 陶琳丽*， 张 曦*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明 650201；2.云南省楚雄州牟定县新桥镇畜牧兽医站，云南牟定 675501；3.大理白族自治州动物卫生监督所，云南大理 671000；4.云南省兽药饲料监测所，云南昆明 650201）

黄曲霉毒素（AFT）是黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物，是一组有着类似结构的化合物总称。黄曲霉毒素B1（AFB1）是目前已知的致癌性最强的一种化学物质（Iarc，2010），主要作用的靶器官是肝脏，对人和动物都能造成极大的损伤。玉米作为能量饲料原料供给动物，间接被人类食用，由于玉米中黄曲霉毒素污染普遍，且以AFB1为主，成为人们最关注的农作物之一（高秀芬等，2011）。根据饲料卫生标准 （GB 13078-2017）， 玉米中AFB1限量要求不超过50 μg/kg，但据相关文献报道，我国饲料原料霉菌毒素污染超标比例高达一半以上（程传民等，2014）。因此加强对玉米中AFB1的监测是饲料安全监管部门每年的重点工作。

目前，国内外检测霉菌毒素的方法主要有酶联免疫吸附（ELISA）法（Oplatowska-Stachowlak等，2016）、薄层色谱（TLC）法（柳其芳，2006）、毛细管电泳（CE）法（王晓琳等，2015）、气相色谱（GC）法与气相色谱-质谱联用（GC-MS）法（马晓宇和林英庭，2018）、高效液相色谱（HPLC）法（刘柱等，2014）与高效液相色谱-质谱联用 （HPLCMS）法 （殷秋妙等，2018），其中，ELISA 法和HPLC-MS法是检测饲料中AFB1最常用的方法。ELISA法是一种把酶的高效催化作用与抗原抗体的特异性免疫反应有机结合起来的检测技术，其操作快速便捷、灵敏度高、安全性高、污染少、干扰小。HPLC-MS法可同时对多种毒素进行定性和定量检测，易于控制，定量准确度高，适用于饲料中6种黄曲霉毒素的定性、定量检测 （殷秋妙等，2018；王瑞国等，2015）。本实验通过ELISA法和HPLC-MS法对玉米中AFB1含量进行测定比较，讨论两者之间的差异及相关性，为今后玉米中AFB1的检测工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 玉米，从多家饲料企业送检的玉米样品中取样30份，用四分法缩减取200 g，用粉碎机粉碎后过40目筛，混匀装入自封袋中备用；甲醇、乙酸、甲酸、乙腈，均为色谱纯；氯化钾，氯化钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠，吐温-20、盐酸、氢氧化钠，均为分析纯；蒸馏水和超纯水；黄曲霉毒素B1标准品，纯度≥97.0%，浓度为 20 μg/mL；玻璃纤维滤纸，直径11 cm，孔径1.5 μm；黄曲霉毒素B1/玉米赤霉烯酮/T-2毒素三合一免疫亲和柱，北京华安麦科生物技术有限公司；ELISA试剂盒，北京龙科方舟生物工程有限公司。

黄曲霉毒素B1标准中间液：根据使用需要，准确吸取一定量的黄曲霉毒素B1标准溶液，用复溶液或玉米空白基质液稀释，分别配成浓度为1000 ng/mL的中间液1和100 ng/mL的中间液2，现配现用。

黄曲霉毒素B1标准工作液：分别吸取一定量的中间液2，用复溶液或玉米空白基质液稀释，分别配出两组浓度为 0.5、10、25、50 ng/mL 的标准工作液，现配现用。

1.2 仪器与设备 AL104电子天平（METTLER TOLEDO）；300 g摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；SHA-B恒温振荡器（常州智博瑞仪器制造有限公司）；GENIUS 3涡旋混匀器（IKA@VORTEX）；H2050R 高速冷冻离心机（Xiangyi Centrifuge Instrumen Co.,Ltd）；N-EVAP111氮吹仪 （Organomation Associates,Jnc）；SPE-12A 12孔固相萃取装置 （上海启前电子科技）；TSQ QUANTIVA高效液相色谱—串联质谱仪（Thermo Scientific）；KHB ST-360酶标仪（上海科华实验系统有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 酶联免疫法 ELISA法是一种把酶的高效催化作用与抗原抗体的特异性免疫反应有机结合起来的检测技术。在本实验中，ELISA法是按照GB/T 17480-2008《饲料中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法》来检测，其基本原理是利用抗原和抗体先结合到某固相载体表面，将标准溶液或待测样品（含待测抗原和抗体）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体表面的抗原或抗体反应，形成免疫复合物，反应终止时，免疫复合物与待测物中抗原或抗体的量成一定比例关系，经洗涤反应液之后，再加入酶反应底物，底物即被固相载体上的酶催化为有色产物，最后用目测法或仪器法通过与AFB1标准溶液比较判断或计算试样中AFB1的含量（肖桦等，2006）。结合本实验所选用的AFB1定量检测试剂盒，检测同样基于抗原抗体反应，酶标板微孔条上预包被AFB1抗体，加入校准品/样品，AFB1-HRP（黄曲霉毒素B1酶标记物）后，校准品/样品中残留的AFB1同AFB1-HRP竞争微空条上预包被抗体的抗原结合位点，因此结合在微孔条上的AFB1-HRP量与校准品/样品中残留AFB1的浓度呈负相关，经TMB底物显色，样品吸光值与其残留的AFB1的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中AFB1的含量。

前处理：称取（5±0.1）g粉碎后过筛的玉米样品于离心管中，加入25 mL 70%甲醇溶液，充分振荡提取3 min，静置后取上清液4000 r/min离心5 min，向500 μL样品稀释液中加入离心后的上清液500 μL，取混匀液用试剂盒进行检测。

检测参数设置：样品经酶联免疫试剂盒反应后，立即用酶标仪定量，即在450/630 nm双波长下读取吸光度值。

1.3.2 高效液相色谱—质谱联用法 HPLC-MS法是按照NY/T 2071-2011《饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定 液相色谱--串联质谱法》进行测定，采用色谱保留时间和质谱碎片及其离子丰度比定性，外标法定量。但在质谱检测中，必然存在干扰待测物质离子化的物质，也就是除了待测物本身其他存在的物质都可能间接或直接引起待测物响应，引发待测信号抑制或增强的现象，由此产生基质效应。引发基质效应的物质包含生物样品中的内源性成分和样品前处理过程中引入的外源性成分，意味着样品本身、样品基质、样品前处理过程，色谱条件和不同离子化模式都可能对检测结果产生影响，这些影响是个十分复杂的过程（Matuszewski等，2003）。因此本实验设计两组用于外标定量的标准曲线，一组选用和待测样品同源的玉米做空白基质加标，过程相对复杂，成本较高；另一组直接采用复溶液加标为纯标，相对简单省时，成本较低；样品按照农业农村部标准和免疫亲和柱操作步骤进行前处理，分别使用两条标准曲线外标计算结果，与酶联免疫法测出的结果相比较，讨论几者之间的差异及相关性，为今后玉米中AFB1的检测工作提供参考。

前处理：称取（5±0.1）g粉碎后过筛的玉米样品于离心管中，加入25 mL提取液（80%乙腈-水溶液）提取，在恒温振荡器（200～300 r/min）上剧烈振荡20 min，用高速离心机（400 r/min）离心5 min，取5 mL离心后的上清液加入35 mL稀释液稀释，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至澄清，取20 mL滤液过柱。取出接近室温的免疫亲和柱，完成亲和柱与固相萃取装置的连接，在亲和柱上方连接装有20 mL滤液的注射器针筒，调节固相萃取开关，使滤液以1～2滴/s的速度流出，待液体排干后，先用10 mL洗涤液洗涤一次，再用10 mL超纯水洗涤一次，流速为2～3滴/s；待液体排干后，调节装置开关关闭，在亲和柱内加入2 mL洗脱液，静置3 min，然后以1滴/s速度洗脱，收集洗脱液，在50℃的氮气下吹干洗脱液，用1 mL甲酸乙腈溶液复溶，过0.22 μm有机滤膜，装瓶上机。

检测参数设置：色谱柱：C18柱（长度50 mm，内径 1.9 μm）；流动相：0.1%的甲酸溶液和 1∶1 的甲醇乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；柱温：33 ℃；进样量：5 μL；质谱检测器。

1.4 统计与分析

1.4.1 ELISA法数据处理 所有数据采用Microsoft Excel软件进行整理，根据公式计算样品的百分吸光率，以校准品的百分吸光率为纵坐标，以AFB1校准品含量（μg/kg）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样品的百分吸光率带入标准曲线，从标准曲线上读出所对应的样品含量。根据选用的试剂盒说明书，结果判定为：若检测结果小于2 ppb应报告为小于2 ppb，若结果大于2 ppb小于50 ppb则报告实际定量结果，若检测结果大于50 ppb即报告大于50 ppb。

式中：B为校准品或样品的平均吸光度值；B0为0 μg/mL标准溶液的平均吸光度值。

1.4.2 HPLC-MS法数据处理 所有数据采用Microsoft Excel软件进行整理，基质加标组标准曲线用玉米基质液 （空白玉米经前处理复溶所得）稀释AFB1标准品配制上机标准点，以上机标准点浓度为横坐标，上机测出的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品上机后的相对离子丰度比是否在最大允许偏差范围内，定性判定样品中是否存在AFB1，如不存在，则判定为未检出，如存在，则将该峰的峰面积带入标准曲线计算得出样品上机浓度（ng/mL），根据前处理的稀释过程，计算玉米中AFB1的含量；纯标组标准曲线用复溶液直接稀释AFB1标准品配制上机标准点，其余处理同基质加标组。样品中黄曲霉毒素B1的含量（Xi）以质量分数表示（μg/kg），用下列公式计算：

式中：Ci为样品上机浓度，ng/mL；V1为提取液体积，mL；V2为待稀释滤液加稀释液之后的体积，mL；V3为复溶体积，mL；V4为待稀释的滤液体积，mL；V5为待上样检测的滤液体积，mL；m 为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 HPLC-MS两组标准曲线的结果 如图1所示，当AFB1上机浓度为30.89 ng/mL，即样品含量为61.78 μg/kg时，两条曲线峰面积相等。当AFB1上机浓度＜30.89 ng/mL， 即样品含量＜61.78 μg/kg时，在同一上机浓度下，纯标组的峰面积＞基质加标组的峰面积；当上机浓度＞30.89 ng/mL，即样品含量＞61.78 μg/kg时，纯标组的峰面积＜基质加标组的峰面积。

图1 玉米黄曲霉毒素B1标准曲线

2.2 玉米中黄曲霉毒素B1含量的测定结果 由表1可以看出，使用ELISA和HPLC-MS检测同一份样品，1～12号样品的AFB1含量均低于酶联检出限（＜2 μg/kg），使用 HPLC-MS 同样未检出（＜1 μg/kg）。 13 号玉米使用 HPLC-MS 未检出 AFB1，ELISA检出含量为2.2 μg/kg，十分接近酶联检出限（2 μg/kg）。而14～17号玉米检测结果具有相同特征，用ELISA检测都低于酶联检出限（＜2 μg/kg），14、16、17号玉米用HPLC-MS检测，在纯标组曲线上得到的结果均低于液质联用检出限（＜1 μg/kg），但都能出峰，且样品中AFB1保留时间与标准溶液保留时间的偏差不超过标准溶液保留时间的2.5%，定性离子丰度比与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子丰度比偏差亦在允许范围内，可定性判断出峰物质为AFB1，但两组曲线下的HPLC-MS检测结果又具有差异，在纯标组标准曲线上得到的结果基本小于2 μg/kg，与酶联检出结果十分符合，而在基质液加标组标准曲线上得到的结果为4.87～5.72 μg/kg，高于酶联检测结果的4～13倍。18、19号玉米用ELISA检出的结果高于酶联检出限1 μg/kg左右，但两组曲线下的HPLCMS检测结果特征与14～17号玉米结果类似。20～25号玉米的检测结果虽有差异，但总体特征相符，具体表现为用ELISA检测出的AFB1含量与HPLC-MS（纯标组）检测结果的偏差很小，平均偏差 为 0.93 μg/kg， 最 小 偏 差 为 0.42 μg/kg； 用HPLC-MS（玉米基质液加标组）检出的AFB1含量平均高于用ELISA或HPLC-MS（纯标组）检出结果的2.2倍。26号和27号玉米在两种HPLC-MS检测曲线下的结果比较接近，偏差为1～3 μg/kg，高于用ELISA检出结果的2～2.5倍。28～30号玉米样品不论使用ELISA还是HPLC-MS检出的结果都高于曲线范围，且都超过饲料卫生标准中AFB1的限量要求，均为AFB1超标样品。

表1玉米中AFB1检测结果对比表 μg/kg

总体来说，30份样品用ELISA检测或HPLC-MS检测都能判定玉米中AFB1含量是否超标，且判定结果一致，但具体检出量存在差异。样品中AFB1含量低于ELISA检出限的，基本也低于HPLC-MS检出限；低于HPLC-MS检出限但能出峰，且峰定性判定为AFB1的，AFB1测定结果ELISA≈HPLC-MS（纯标组）。当样品中AFB1含量为2～6 μg/kg时，测定结果 HPLCMS（纯标组）＜ELISA＜HPLC-MS（玉米基质液加标组），且HPLC-MS（玉米基质液加标组）测定值约为ELISA和HPLC-MS（纯标组）的2～13倍；当样品中 AFB1含量＞11 μg/kg时，测定结果ELISA＜HPLC-MS（纯标组）≈HPLC-MS（玉米基质液加标组）。当样品中AFB1含量用ELISA检测高于限量要求的，用HPLC-MS检测也同样超出限量要求，且HPLC-MS（纯标组）的测定结果均最大。

3 讨论

本实验中30份玉米样品，用ELISA检测AFB1的检出率为 40%，HPLC-MS的检出率为57%，两种方法检测AFB1超标率均为10%，相较谢文梅等（2017）测得2017年1～6月全国各地玉米AFB1检出率88.89%，此次检测的玉米样品受AFB1污染较轻，只有个别玉米含量超标，与黄俊恒和黄广明 （2018）2017年检出华中地区玉米样品AFB1超标率10.5%相吻合，说明近年来玉米相较其他谷物受黄曲霉毒素B1污染趋势有所下降，但仍然属于易被污染范畴（谢文梅等，2017）。当AFB1测定结果在限量要求内时（＜50 μg/kg），用 ELISA检测的结果均小于HPLC-MS（玉米基质液加标组）测定结果，HPLC-MS（纯标组）测定结果也均小于HPLC-MS（玉米基质液加标组）测定结果；当HPLC-MS测定值在AFB1限量要求范围内时（＜50 μg/kg），在同一上机浓度下，基质加标组的峰面积均小于纯标组的峰面积，因此基质的存在可能导致离子减弱效应，引起较低的响应信号，表现为峰面积较小 （徐炎炎等，2017）。所以在本实验中，当玉米中AFB1含量未超过61.78 μg/kg时，可对比得出玉米基质对AFB1出峰面积的影响为基质减弱效应，但在基质加标曲线上外标定量得出的样品含量平均高于纯标曲线的3.6 μg/kg左右，这可能由于基质玉米本底含有少量的待测物所致；反之，当玉米中AFB1含量超过61.78 μg/kg时，则表现为基质增强效应。

在本实验中，玉米AFB1含量在限量范围内时，ELISA阳性判定结果与HPLC-MS（纯标组）基本一致，假阳性为0，因此即当检测样品数量众多，涉及范围或地域广时，可用ELISA进行初筛，节约时间和成本，再用HPLC-MS对阳性样品和超标样品进行复检，或者用HPLC-MS对不同样品含量分布范围内的样品进行抽检，验证ELISA测定结果；但ELISA作为一种快速筛选手段，行标或者国标很少，因此给判定结果带来不确定性，往往在检测过程中易出现假阳性，若要降低假阳性，除了可适当增大稀释倍数以外，使用其他检测手段复检也必不可少（贾卫昌和朱寅，2015；何方洋等，2015）。使用HPLC-MS法定性定量检测玉米AFB1更加准确，把色谱的高分离度、高灵敏性和质谱检测器的高选择性、高灵敏性相结合（张明等，2018），可对ELISA检测结果进行验证和复检。当ELISA测定结果＜2 μg/kg时，HPLC-MS可选用纯标曲线进行验证；当 ELISA测定结果为 2～6 μg/kg时，HPLC-MS选用纯标曲线得出的结果十分接近ELISA，选用基质液加标曲线得出的结果是前两者的2～13倍；当ELISA测定结果＞11 μg/kg时，HPLC-MS选用纯标曲线或基质液加标曲线都可以，两者都是ELISA测定结果的1～2倍。在样品中AFB1含量＜61.78 μg/kg时，若考虑待测样品量多，节约成本，缩短前处理时间等因素，运用HPLC-MS法可实际选用配制纯标曲线，定量得出的结果加上3.6 μg/kg即可大致相关为基质加标曲线得出的样品含量。

目前，ELISA法和HPLC-MS法都是检测样品中AFB1含量的常用方法。ELISA法基于抗原抗体特异性反应，操作简便快速，特异性强，与HPLCMS法相比，简化了样品前处理和上机过程，非常适用于玉米样品中黄曲霉毒素B1的大量初筛。HPLC-MS法采用免疫亲和柱纯化，同样基于抗原抗体的特异性结合，虽检测灵敏度高，准确性好，但前处理较为复杂，检测时间较长，经济成本较高，亲和柱有可能出现洗脱不完全的情况，且黄曲霉毒素质量极轻，复溶后使用氮气吹干时容易把毒素吹飞，操作者对氮气吹干程度的把控也存在差异，因此HPLC-MS法适用于对ELISA的验证和复检。

4 结论

本研究利用酶联免疫（ELISA）法和高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）法测定玉米样品中AFB1含量，得到两种方法在检测玉米中AFB1含量为0～50 μg/kg和大于 50 μg/kg之间的相关性，ELISA对AFB1的检出判定和HPLC-MS基本一致。当配制HPLC-MS标准曲线时，可根据情况选用纯标曲线或基质液加标曲线外标定量。在实际工作中，如果掌握了两种方法之间的差异性和相关性，就可互补两者之间的检测判定，提升检测效率和准确率，同时为准确定量玉米中黄曲霉毒素B1含量提供数据参考。