简 磊,符策岗,揭 勇

(1.三峡大学附属仁和医院内分泌科,中国湖北宜昌443000;2.上海市第六人民医院-海口骨科与糖尿病医院骨科,中国海南海口570000;3.三峡大学附属仁和医院,中国湖北宜昌443000)

糖尿病是影响人类健康的主要代谢性疾病之一。一项全球性研究表明,在20岁以上的成人中,身体质量指数(body mass index,BMI)≥30 kg/m2的人数大约占35%。他们均被定为肥胖,这一类人群不仅容易患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM),而且还高发不孕不育、高血压以及骨骼方面疾病等[1]。在中国,随着人口老龄化与生活方式的改变,糖尿病从一种少见病逐渐演变成一种流行病,在1980年到2013年期间,患病率从0.67%飙升至10.4%。根据病因学证据,糖尿病可分为4大类,即1型糖尿病、2型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病。临床上绝大多数的糖尿病患者都属于T2DM,此类疾病一旦确诊,往往面临余生几十年的不断用药,折磨着全球10%的成年人(其中30%的人与遗传有关)[1]。T2DM的病因和发病机制目前尚不明确,其显著的病理生理学特征为:1)胰岛素调控葡萄糖代谢的能力下降(胰岛素抵抗);2)胰岛β细胞功能缺陷所导致的胰岛素分泌减少(或相对减少)。T2DM的治疗一开始多依赖于口服药物,口服药的治疗机制围绕以下几个方面:刺激胰腺分泌胰岛素、增加胰岛素的敏感性、减少胃肠道对糖分的吸收、抑制糖异生、抑制胰高血糖素分泌、抑制葡萄糖重吸收等等。遗憾的是,这些药物最终都不能让机体产生足够的内源性胰岛素,反而随着时间的推移,胰岛细胞分泌胰岛素的功能逐渐衰竭,从而不得不开始通过注射人工胰岛素来补给身体的需求。T2DM病程长、并发症多和终身服药给患者和患者家属都带来了巨大的心理和经济负担,严重降低患者的生活质量。因此,进一步研究T2DM的病理机制以从源头上降低发病率,或者研发新药物以减少患者的用药成本及用药频率,又或者发现新的治疗方式以攻克此病变得刻不容缓。

就目前研究而言,T2DM发病机制复杂,具体表现在以下几个方面:1)涉及多基因性病变;2)在一定的环境下发病率将有所提高;3)涉及许多参与糖代谢调节的细胞、组织和器官(肌肉、肝脏、脂肪、胰腺等)。完全阐明T2DM的病因及发病机制是极具挑战性的,这需要全面地了解基因和环境相互作用对细胞、组织和器官功能的影响。众所周知,医学实验不能开始于人体,早期应在特定的动物模型上开展,且这些动物的基因需要与人类具备一定的相似性。被用于研究的动物模型,承载着人们对攻克T2DM的所有设想,这些动物模型不仅要能很好地模拟人类疾病,而且对药物的反应也需要与人类相似。小鼠因为其基因和表型能很好地模拟人类疾病且实验成本相对较低而被广泛使用,目前已开发出的2型糖尿病小鼠模型种类繁多,包括:自发突变性模型、热量过量性模型、外科和化学诱导性模型、常用转基因小鼠模型、专门用于研究环境对基因影响性的模型、CRISPRCas9构建模型以及特定的糖尿病肾病模型。本文主要就2型糖尿病现有的小鼠模型及其构建的方式给予简要的综述。

1 自发突变性小鼠模型

在通过调控条件或基因而获得特异性T2DM动物模型这一方式普及之前,大量的研究依赖于选择性育种,即自发突变性动物模型。尽管构建动物模型的方式和技术层出不穷,但许多自发突变性动物模型至今仍在使用,主要原因在于它们具有良好的特异性,倾向于产生严重的可重复的糖代谢缺陷模型,更加符合生物学性状,理论上也是很理想的动物模型,可以更好地反映T2DM的复杂本质。

db/db小鼠模型是一类常见的自发性糖尿病小鼠模型,其特性是,位于4号染色体上的瘦素蛋白受体(leptin receptor,Lepr)基因发生突变(Gly取代Thr),从而导致Lepr沉默和高瘦素血症[2]。但是这类小鼠很大程度上都伴随:1)高度不孕;2)不同性别小鼠脂肪组织中类固醇磺基转移酶的表达存在差异,最终导致糖尿病严重性存在差异;3)基于代偿系统而维持正常代谢的可能[3～4]。

TH(TallyHo/JngJ)小鼠是一种近代杂交的泰勒源性小鼠,它自发产生高血糖和高胰岛素血症,但无低血磷血症,也无Lepr缺陷[5～6]。TH小鼠的这些遗传特征都来源于19号染色体上的一个隐性遗传基因Tannidd1(Tallyho相关非胰岛素依赖型糖尿病)与一系列位于其他染色体上的Tallyho相关位点(包括 Tanidd2、Tanidd3、Tabw2 和 Tafat)之间的相互作用[5]。TH小鼠是典型的多基因病变性T2DM小鼠模型,伴随中度肥胖并胰岛素抵挡,表现为高血糖、高胰岛素血症、高脂血症和胰岛β细胞增多[5～6]。因此,TH小鼠与人类肥胖相关T2DM有许多相似之处,但是需要注意的是,只有雄性小鼠充分表现出高血糖及糖耐量受损,雌性小鼠并没有这样的表现。

KK/Ta小鼠也是一种良好的T2DM模型,来源于日本小鼠近亲交配。雄性KK/Ta小鼠自发地表现出一些与T2DM相似的症状,比如:高血糖症、糖耐量受损、胰岛素血症、轻度肥胖和微量白蛋白尿(糖尿病肾病表现)等,但雌性在这方面的表现相对较轻[7]。由于KK/Ta小鼠的表型没有显著特征,因此有研究者将黄色肥胖基因(Ay等位基因)转移到KK/Ta小鼠,制备出新型Kish-Ay小鼠。KK-Ay小鼠表现出明显的肥胖和高血糖,而且糖化血红蛋白和白蛋白尿也明显升高[8]。KK-Ay小鼠品系自1969年被成功建立以来,就被广泛用于T2DM 的实验模型[8～13]。

1949年,Jackson等发现了ob/ob小鼠。ob/ob小鼠来源于家鼠(Mus musculus)的偶然突变,且这个突变最终转移到近交C57BL/6J小鼠中。突变后的小鼠在2～14周龄内迅速增长,体重比野生型(C57BL/6J)高3倍左右[14]。经过克隆并测序,人们发现ob/ob小鼠6号染色体上的ob(瘦素基因)发生突变,使Arg的密码子被一个终止密码子取代,从而导致无法转录正常的功能蛋白质[15]。因此,突变小鼠表现出低胰蛋白酶、食欲过盛、肥胖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、14～16周后会消退的高血糖、高密度脂蛋白升高和伤口愈合延迟等症状[14]。ob/ob小鼠可能是极为罕见的单基因突变型T2DM模型,目前常用于瘦素相关的研究。

2 热量过量性小鼠模型

高脂饮食(high-fat diet,HFD)小鼠是目前最受欢迎的T2DM动物模型之一,主要原因在于其很容易构建。此模型建立在HFD喂食的基础上,通常是使用含有5%～60%脂肪(猪油)的食物持续喂食小鼠1～20周,喂食长短取决于研究所需模型病变的严重程度[16]。一般情况下,在60%的HFD喂食1周后,小鼠表现出葡萄糖耐量受损和胰岛素分泌增加[1],2～4周后体重明显增加,8～12周时口服/静脉/腹腔葡萄糖耐量实验和葡萄糖刺激胰岛素释放实验的结果将出现明显变化,体重将在16～20周达到最大,最终体重通常比野生型重20%～30%[1,16]。这类小鼠模型通常表现为肥胖(包括脂肪细胞增生和肠系膜脂肪沉积)、高血压、高血糖和高胰岛素血症(空腹胰岛素水平升高和胰岛素抵抗)。因为HFD小鼠能很好地模拟人类T2DM的进展,并表现出胰岛素抵抗、胰岛β细胞增多及β细胞功能破坏等特征,从而被人们所青睐。

值得注意的是,不同小鼠如C57BL/6J、129×1、DBA/2和FVB/N对HFD喂养的反应存在差异[17]。而且,即使是同种小鼠(如C57BL/6J),其对HFD喂养的反应(“低”和“高”)也存在一定异质性,在表型上也有一定差异[18],这就意味着应该密切监测食物摄入量和体重的变化。除此之外,性别差异也是存在的,比如:C57BL/6雌性小鼠普遍对葡萄糖耐受性低、全身炎症反应和胰岛素水平偏向正常且胰岛肥大[19]。

3 外科和化学诱导性小鼠模型

此类模型主要通过外科或化学方式(包括细胞特异性毒素)去除涉及能量平衡调节的系统,从而诱导肥胖小鼠模型。本文集中讨论物理和/或化学方式在脂肪组织和胰腺方向的研究。

人类功能性棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)存在于颈部锁骨上,由于其活性与肥胖和代谢综合征指数呈负相关,因此BAT常用于与人类肥胖和糖代谢紊乱相关模型的建立[20]。研究发现,通过诱导脂肪细胞特异性表达白喉毒素消除小鼠的BAT,可引起肥胖和食欲过旺,表现为缺乏解偶联蛋白-1(uncoupling proteins,UCP-1)驱动的热能耗散[21]。此外,切除BAT被证实可用于构建胰岛素抵抗和T2DM小鼠模型[21],此类模型具有以下特征:食欲旺盛、高胰岛素血症和能量消耗增加[22]。

胰腺是通过β、α和δ细胞分泌胰岛素、胰高血糖素和生长抑素发挥调节能量平衡的作用。其中胰腺β细胞一直是研究的热点,β细胞功能丧失与T2DM的发生和发展(在糖尿病小鼠研究的条件下)密切相关[23]。在Banting和Best首次发现β细胞分泌胰岛素后的几十年里,针对β细胞功能的研究层出不穷。Lenzen[24]研究发现,四氧嘧啶和链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)能促进β细胞坏死,并诱导糖尿病的发生。近期有研究显示,四氧嘧啶和STZ通过破坏β细胞中的葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter 2,GLUT2)来影响糖代谢。而且人们还发现,GLUT2不仅存在于胰腺内,在肾脏和肝脏中也有表达,因此四氧嘧啶和STZ也会在肝肾中发挥细胞毒性作用[25]。四氧嘧啶是葡萄糖激酶(glucokinase,GK)的抑制剂,诱导产生活性氧,从而导致β细胞功能障碍和死亡[24]。STZ的甲基亚硝基脲部分是其发挥毒性作用的关键,可以影响蛋白质修饰、基因组和破坏线粒体DNA,并最终导致β细胞功能障碍和死亡[24]。β细胞的功能被四氧嘧啶和STZ破坏后,将引起葡萄糖代谢的紊乱。值得一提的是,STZ比四氧嘧啶更适用于啮齿动物的糖尿病模型构建,主要原因在于它是一种相对稳定的化学物质,可确保小鼠模型的稳定构建。

相关追踪研究分析发现,胰腺内分泌细胞与BAT类似,也能被细胞特异性表达的白喉毒素所破坏[26]。此外,也有研究尝试通过外科手术方法在胰岛区注入腺体相关病毒(adeno-associated viruses,AAVs),以破坏胰岛功能而达到构建T2DM小鼠模型的目的。但此法对造模者技术的要求十分苛刻,否则很容易误将AAVs注射到肠系膜动脉或胰管内[27]。

4 转基因小鼠模型

β细胞的代偿性增多是T2DM的特点之一,其另一特点是肌肉、肝脏和脂肪组织对胰岛素抵抗,这两者之间具有密切的内在联系。在T2DM早期,为了在功能上补偿胰岛素抵抗,机体β细胞出现代偿性的增多[23,28]。随着病情的发展,β细胞出现衰竭,随即血糖水平升高,除此之外,α细胞持续分泌糖原(分解糖原/胰高血糖素分泌)也进一步加剧了血糖的失调[29]。目前对生长抑素分泌细胞δ细胞知之甚少,有研究推断它们可能以旁分泌方式抑制胰岛素和胰高血糖素释放[30]。在糖尿病发生发展的过程中,胰岛素抵抗、α和β细胞相互作用的机制目前尚不完全了解,这也是治疗该疾病的主要障碍。现阶段,临床上针对糖尿病的治疗如果想有所突破,最大的障碍在于攻克β细胞分泌胰岛素或β细胞再生的难题。其中,可用于研究胰岛细胞功能的T2DM小鼠模型是关键部分。

4.1 β细胞特异性靶向糖尿病小鼠模型

早期人们通过大鼠胰岛素启动子Cre(rat insulin-2 promoter-Cre,Rip-Cre),也被称为Ins2基因,调节大鼠胰腺β细胞对胰岛素的分泌,从而调节葡萄糖代谢[31～32]。根据所使用的Rip-Cre转基因技术的精确性,β细胞的重组效率可达80%～98%。但在研究过程中人们发现,除了胰腺以外,脑组织中也会发生重组(如下丘脑),这对实验会产生额外的影响[31～32]。有意思的是,胰腺和十二指肠源性胰岛素启动子1(Pdx1)在与β细胞重组时,不会与大脑细胞产生额外的重组,这似乎更具有优势[31～32]。遗憾的是,无论是 Rip-Cre还是 Pdx1-Cre技术,在用于那些主要表达Ins1而不是Ins2的动物时受到了限制。Ins1 CreERT(MIP-CreERT)也是人们研究的热点之一,在Ins1 CreERT转基因动物大脑内也未检测到额外的重组[32]。有研究报道,Ins1-Cre转入C57BL/6J小鼠后,能促进催乳素受体自分泌,并刺激β细胞增殖[33]。需要注意的是,在选择Ins1-Cre用于动物实验时,必须确保该动物具有内源性Ins1基因,因为Ins1-Cre的表达依赖于内源性Ins1基因的Cre起始密码子[34]。此外,还应当注意,在此法的刺激下胰岛素表达增多,但当胰岛素处于高浓度时,又会反射性地引起β细胞发育不全[1]。总的来讲,目前一些实验动物是通过相对较新的方式构建的,仍然需要更深入研究以排除其他干扰存在的可能。

4.2 α细胞特异性靶向糖尿病小鼠模型

与上述不同,针对α细胞的胰高血糖素启动子(glucagon promoter-driven Cre,Glu-Cre)早在10年前就已经开始用于构建T2DM小鼠模型,其机制是通过将含有胰高血糖素(glucagon,Gcg)启动子的短(1.6 kb)启动子片段转入C57BL/6J小鼠从而提高胰高血糖素表达[1]。虽然研究的早期重组效率很高,但是随着时间的推移,重组率从开始的100%下降到40%,这可能与实验者、实验对象以及检测的手段都有关系[35]。人们在C57BL/6J小鼠模型中发现,通过iCre上调胰高血糖素基因(glucagon-iCre,Glu-iCre)表达时,不仅α细胞中Cre的表达增高,而且70%的肠内分泌性L细胞的表达也增高,以此上调血糖水平[36～37]。近期有研究使用CRISPR-Cas9基因编辑技术,在不破坏胰高血糖素表达的前提下,将CreER插入到内源性Gcg基因中,以此方式构建的小鼠模型所产生的胰高血糖素CreER显示是正常表型,且在成年C57BL/6J小鼠α细胞(～95%)中显示出良好的重组效率,但是仅在33%的L细胞中检测到Cre的表达[35],因此该法与Glu-iCre动物模型相比还是略显不足[36]。

4.3 其他特异性靶向糖尿病小鼠模型

构建转基因T2DM小鼠模型,除了针对分泌激素的细胞本身外,还有激素的受体和激素在细胞中的转运途径等靶向。胰岛素发挥作用必须依赖于葡萄糖转运蛋白的协助,其中GLUT2存在于肝、肾、β细胞和小肠,而GLUT4存在于肌肉、脂肪和心肌细胞。人们通过Cre/loxP DNA结合技术降低GLUT4的分泌或敲除GLUT2基因都可显著地引起胰岛素抵抗和糖尿病的发生[38～39]。此外,胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)蛋白调节胰岛素的自我平衡、细胞的成长和存活,通过选择性敲除IRS基因也能引起小鼠胰岛素抵抗和糖尿病的发生[40]。Abel等[38]证实这一类动物模型对于开展正常胰岛功能下的胰岛素抵抗和胰岛素受体相关的研究有独特的优势,但需要注意的是,此法所构建动物模型的病情严重程度常偏低。

5 用于研究环境对基因影响性的T2DM小鼠模型

T2DM这类复杂的代谢性疾病通常是由基因-环境(gene-by-environment,GxE)相互作用引起的。虽然使用全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)和基因工程小鼠模型可以鉴定代谢疾病发展的遗传危险因素,但由于无法控制环境因素(至少在人类研究中),以及近交系小鼠的单一遗传背景等因素,GxE难以被完全阐明。在小鼠模型构建上,研究者常常通过重组近交系遗传参考群体(genetic reference population,GRP),也就是常用的近亲交配的手段,达到有效减少模型之间差异的目的[41]。当研究某个基因时,首先将单个染色体从供体转入宿主(如C57BL/6J小鼠)内,这类实验宿主之间的差异性必须缩小,且宿主的生活环境必须精心的控制(包括饮食、温度和光照等),这样的条件下才有利于鉴定GxE。此外,GRP为人们提供了一个强大的平台,以理解基因组的某些区域如何影响表型,如何与环境相互作用,甚至可以通过与亲本序列数据反向GWAS比较来确定与人类代谢疾病有关的潜在基因[42]。例如:140种BXD-GRP代谢特征(葡萄糖耐受性、身体成分、血压等)的临床表型被证明具有高度可调节性和遗传性,并且可以与已知的基因变体相关联,为构建稳定T2DM模型打下了坚实的基础[42]。

6 CRISPR-Cas9:T2DM模型的未来

近年来CRISPR-Cas9技术实现了针对单个核苷酸的编辑(在内源基因组中),并且已被运用到那些能被人类GWAS所识别的基因中,甚至可以用于构建突变性小鼠模型。人们在肥胖基因FTO的研究中发现,rs1421085中T变C的单核苷酸变化可以将BAT转换为白色脂肪组织,从而减少线粒体产热并增加脂质储存,其效果类似于破坏BAT[43]。虽然啮齿类动物可以通过此方法构建模型,特别是在遗传型难以控制的组织(例如胰腺)中,但应该注意的是,那些被GWAS识别的人类基因组序列并不是全部都存在于小鼠中,这限制了该技术的使用范围[44]。此外,虽然CRISPR-Cas9可用于沉默Cre[35],但同源重组发生率不高。因此在构建小鼠模型方面,对比传统的方法其优势并不明显。但是就前景而言,CRISPR-Cas9技术如果用于灵长类动物,对比其他方式其模拟性更强,当然这也需要在进一步提高重组率的前提下才能实现。

7 糖尿病肾病模型

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)在糖尿病合并症中的发病率居首位,也是糖尿病患者最重要的致死病因之一。DN的发生与多种因素的综合作用有关,主要包括:血糖控制不佳、生化改变、遗传因素、摄入过量的蛋白质、高血压、生长激素和胰高糖素分泌过多、脂肪代谢异常、血小板功能亢进、肾脏血流动力学异常、结构异常及吸烟等等。糖尿病患者一旦发生肾脏损害,并出现持续性蛋白尿,则肾功能很可能持续性减退直至终末期肾功能衰竭,至今尚无有效措施阻止其发生与发展。DN治疗上一直没有突破性的进展,其中的障碍之一就是缺乏良好的实验动物模型[45]。良好的DN动物模型不仅需要满足糖尿病模型的标准,还要具备高蛋白尿、肾小球硬化和高血压等特征。

降低糖尿病小鼠模型中的内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),能有效增强肾损伤,并显著地引起高血压和内皮功能障碍。人们在糖尿病模型db/db C57BL/KsJ的基础上开发了一种具有eNOS完全遗传缺陷的小鼠系,这种新型eNOS-/-db/db C57BL/KsJ小鼠模型表现出的高血压、尿白蛋白较对照组高30倍以上,同时呈现广泛的肾小球系膜基质扩张和结节、肾小球膜炎、肾小球基膜增厚、小动脉透明变性和肾小管间质纤维化等与人类DN相仿的症状[46～47]。值得一提的是,eNOS-/-db/db小鼠模型在26周龄时肾小球滤过率降低50%,并且随着蛋白尿的减少开始对血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)类药物耐药,具备与人类DN相仿的特征性表现[48]。

BTBR ob/ob小鼠是另一种DN小鼠模型,由具有胰岛素抵抗的黑色/棕色短尾(BTBR)小鼠品系与ob/ob瘦素突变小鼠杂交得来,表现出明显的高血糖症、尿白蛋白增加、广泛的肾小球系膜基质扩张、局灶性结节性肾小球硬化、轻度肾小球基膜增厚和小动脉透明变性等与人类严重DN相关的症状[49～51]。但是,人们在使用BTBR ob/ob模型时却发现,蛋白尿和肾脏损伤并没有与上述研究介绍的一样那么显著,这可能是环境因素对这些小鼠模型的DN表型产生了影响[52～53]。除了上述两种DN小鼠模型外,还有ob/ob FVB/NJ和ob/ob C57BL/KsJ等模型,但相比之下还是eNOS-/-db/db C57BL/KsJ和BTBR ob/ob小鼠模型与人类DN 更相仿[47]。

表1 目前可用的T2DM小鼠模型及其优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of currently available T2DM mouse models

8 小结

小鼠模型在T2DM的研究中具有极其重要的意义。文中关于目前可用的主要T2DM小鼠模型的总结见表1。从表中可知,没有完美的动物模型存在,且实验本身进一步的验证总是依靠其他实验模型(例如细胞系、人体组织、临床数据等)来补充和确定。此外,从小鼠实验得到的数据也需要仔细考虑控制因素的问题。例如:饲喂HFD的动物应始终与饲喂标准食物的试验组进行平行评估,以避免数据因反应的异质性而混淆。当然,即使假设所有的动物模型都不存在差异,其所生存的环境因素(光、温度、噪音)的细微变化也会对代谢参数产生较大的影响。因此,在构建糖尿病小鼠模型的时候,还应该致力于更好地保持动物模型生存环境的一致性。