张 彬 张 瑜

四川省成都市第五人民医院肝胆外科 611130

肝细胞癌是目前全球范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，术后伴有不良反应的患者5年生存率只有5%左右[1]。主要原因是晚期肝细胞癌的手术机会小，术后复发率高，导致肝细胞癌患者的治疗现状改善不明显[2-3]。探讨研究肝细胞癌的分子发病机制是研究临床治疗的热点方向。miRNA是由20～22个核苷酸组成的非编码RNA，通过特异性结合和切割信使RNAs(mRNAs)，抑制mRNA翻译和脱氨基化来抑制其同源靶基因的表达[4]。miRNA已被认为是恶性肿瘤发生的调节因子。miRNA表达的异常调节在恶性肿瘤细胞的转移过程中经常存在明显的表达差异[5]。另一方面，miRNA的异常表达与肝癌的发展相关[6]。例如，miR-122、mi-26a及miR-195已经被鉴定为肝脏中的肿瘤抑制剂，而miR-21和miR-221可以促进肝细胞癌变[7]。上皮间质转化行为的特征是细胞黏附性的丧失，上皮细胞黏附蛋白E-钙粘着蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白的下调，可以直接干扰影响[8]。据相关研究证实，上皮间质转化行为可直接促进恶性肿瘤进展，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，并诱导肿瘤抗药性的产生[9]。然而，miR-194在肝细胞的进展和上皮间质转化中的作用一直没有得到很好的验证。

miR-194在肝脏中的表达差异被发现很久，但其具体功能机制尚未明确。有研究表明miR-194在肠上皮细分化过程中可以诱导其进展[10]。在本实验目前的研究中，首先在肝癌组织和肝癌细胞中分析miR-194的表达差异，然后通过调控钙粘连蛋白的表达干扰其生物学行为进程，直接影响肝癌细胞的恶性转移行为。

1 材料与方法

1.1 组织标本和细胞培养 在本地医院获得肺癌患者书面知情同意后，采集肝癌组织样本和癌旁正常组织样本，本研究获得医学院审查委员会的批准。蜡块包埋的肿瘤样品用于免疫组织化学研究。HepG2、Hep3B、SNU398和SNU475肝癌细胞购自中国武汉大学典型培养物保藏中心。细胞培养条件：10%胎牛血清补充的改良Eagle培养基，37℃，5%CO2恒温孵箱中培育。

1.2 PCR实验 使用mirVana miRNA分离试剂盒从肝癌组织和对照癌旁正常组织中分离总RNA。使用Nano-2000分光光度计测定RNA浓度和纯度。反应条件按照cDNA合成试剂盒使用说明进行设置。反应条件：95℃预变性10min、95℃变性15s、60℃退火32s，循环50次后检测其溶解曲线，检测完成后，通过计算机系统自动分析各样本Ct值，然后采用2-ΔΔCt计算miRNA的相对表达量。实验重复3次。miR-194引物序列：5’-GTAGCGGTAGCGGATGCGGAGC-3’(正向)和5’-GGATCTATCCCCTAGCGAGTAGGGC-3’(反向)。

1.3 蛋白质印迹测定 使用RIPA缓冲液提取总细胞裂解物，通过配置12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并转移到PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭，并在4℃下与一抗(浓度1∶1 000)一起孵育过夜。 随后，将膜与二抗孵育，最后用ECL底物试剂盒检测，实验重复3次。

1.4 划痕愈合实验 划痕愈合实验通过将肝癌细胞接种到六孔板上进行测定。在肝癌细胞附着于平板并达到100%汇合后，使用无菌吸头通过汇合单层进行刮擦。观察细胞迁移到划痕区域的细胞距离，并拍摄照片，并且对5个随机选择的区域进行统计分析。实验重复3次。

1.5 Transwell侵袭实验 Transwell侵袭实验检测肝癌细胞的侵袭能力。在含有0.1%牛血清白蛋白的无血清培养基中将肝癌细胞加入到上室中，通过基质胶侵入下室的细胞数量用结晶紫染色剂染色，并在37℃，5%CO2下孵育24～36h后计数。观察细胞侵袭到下层小室区域的细胞数目，并拍摄照片，并且对5个随机选择的区域进行统计分析。实验重复3次。

1.6 裸鼠体内成瘤实验 裸鼠成瘤实验：将不同组的2×107的肝癌细胞分别离心，用50μl PBS稀释重悬待用。10只4周左右的裸鼠，分为miR-194-inhibitor组和NC组，每组5只，将两组肝癌细胞分别注射入左侧腋下，2周观察肿瘤形成情况。6周后将肿瘤剥除，将肿瘤组织包埋切片进行检测。

1.7 统计学方法 所有统计分析均使用SPSS17.0(SPSS，Chicago，USA)进行。 数据以均数±标准差表示，统计学分析采用Student’st检验。 使用Pearson相关分析来估计CCAT1和miR-410的表达水平之间的关系。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-194在不同肝癌细胞中的表达水平 通过qPCR实验检测miR-194在肝癌组织中的表达情况。qPCR结果显示：miR-194在肝癌组织中表达水平明显高于癌旁正常组织(1.28±0.16 VS 0.37±0.03)，差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞株中结果显示：miR-194在HepG2肝癌细胞中的表达最高，后续实验选取HepG2肝癌细胞作为实验细胞株。见图1。

图1 miR-194在肝癌组织和细胞株中的表达情况

2.2 miR-194调控钙粘蛋白的表达水平 通过Western blotting实验检测miR-194对肝癌细胞中钙粘蛋白的表达水平的影响。实验结果显示(图2)：转染了miR-194-inhibitor后，E-Cadherin，N-Cadherin和Vimentin蛋白的表达水平相比NC组均明显降低(1.81±0.22 VS 0.52±0.08，2.96±0.39 VS 0.51±0.09，2.06±0.24 VS 1.62±0.22)，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明抑制miR-194后可以调控相关钙粘蛋白的表达，从而干扰肝癌细胞上皮间质转化过程。

图2 miR-194对钙粘蛋白表达水平的影响情况

2.3 miR-194对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响 划痕愈合实验检测结果显示(图3)，与NC对照组相比，抑制miR-194后72h肝癌细胞的迁移能力得到一定程度的减弱[(82.6±15.3)%VS(29.1±8.2)%]，差异具有统计学意义(P<0.05)； Transwell侵袭实验结果显示，与NC对照组相比，抑制miR-194后肝癌细胞的侵袭能力得到一定程度的减弱[(332.6±29.4)%VS(136.8±16.4)%]，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明抑制miR-194的表达对肝癌细胞的迁移和侵袭运动能力有一定的抑制作用。

2.4 miR-194对肝癌细胞体外成瘤能力的影响 两组小鼠在肝中的转移灶不明显，对转移灶肿瘤组织进行苏木精—伊红染色的组织切片。结果如图4所示，抑制miR-194的表达后可以在一定程度上降低裸鼠体内中肿瘤转移灶的数量和大小。表明抑制miR-194的表达可以干扰肝癌细胞的生长发展进程。

图3 miR-194对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响

图4 苏木精—伊红染色裸鼠肝癌转移灶的情况

3 讨论

虽然miR-194在肝脏中的高表达情况早已证明，但其相关功能机制了解不甚清楚。两项关于人上皮细胞分化和肝纤维化的研究揭示了miR-194的可能功能行为。因为这两个过程涉及上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用或转换，笔者推测miR-194可能在肝上皮细胞中特异性表达并在模仿EMT的分化过程中的调控作用。进一步确定miR-194在上皮细胞中的一个潜在作用是调控E-Cadherin和N-cadherin的表达并阻碍EMT期间的钙粘蛋白转换。从而使肝癌细胞系中miR-194的表达降低下调N-cadherin的表达并抑制了细胞的迁移和侵袭过程[11]。另外有相关研究表明miR-194的过度表达可能会逆转某些细胞情况下的细胞分化状态，可能是通过释放间充质细胞中E-钙粘蛋白的转录或翻译抑制[12]。尽管这些结果并不能在完全意义上证实过程，但是揭示了miR-194在维持肿瘤细胞上皮表型和预防EMT过程中潜在的作用[13-14]。

笔者的研究结果表明，miR-194可能特异性地抑制E-钙粘蛋白表达和N-钙粘蛋白表达，但对Vimentin蛋白没有直接的影响作用。在临床情况下，转移性细胞并不总是需要完整的上皮间质转化过程发挥作用，因为Vimentin在许多转移性肿瘤中表达差异不明显。此外，虽然Vimentin蛋白的丧失被认为是上皮间质转化的标志之一，但E-钙粘蛋白表达和N-钙粘蛋白可能是通过增强肿瘤细胞的迁移和转移的必需因子[15]。所以如果E-钙粘蛋白表达和N-钙粘蛋白的外源表达有明显差异，无论Vimentin的表达如何，肝癌细胞都能促进迁移和侵袭[16]。此外，有报道认为N-钙粘蛋白可以促进原发性肝癌的生长，并对肝癌细胞发挥抗凋亡作用[17]。因此，miR-194调控E-cadherin和N-cadherin可能在肿瘤发展过程中发挥重要和多方面的作用

综上所述，miR-194可能通过调控钙粘蛋白的相关表达直接影响肝癌细胞的上皮间质转化过程，从而直接干扰肝癌细胞的迁移和侵袭行为，本研究结果表明，miR-194是一种潜在的肝癌上皮细胞的miRNA标记，并且在原发性肝癌细胞中起着抗转移的作用。 因此，miR-194可能是肝癌的预后和治疗的潜在靶标。