宋东坡，陈晓英，吕亚囡，王伟青，李文杰

(青岛市妇女儿童医院，山东青岛266034)

枫糖尿症(MSUD)是由支链酮酸脱氢酶复合体(BCKD)缺乏引起的一种罕见常染色体隐性遗传病。BCKD主要由支链酮酸脱氢酶异聚体(E1)、二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶(E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)组成。其中E1由两个E1α和两个E1β亚单位组成。E1α亚单位由BCKDHA基因编码合成，E1β亚单位由BCKDHB基因编码合成。E2由DBT基因编码合成，E3由DLD基因编码合成。MSUD临床罕见且病死率极高。本研究分析2014年8月～2017年4月收治的5例MSUD患儿的遗传学病因，首次报道位点的致病性，同时初步讨论突变类型与临床表现的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 患儿1(P1)，男，36周+4，顺产，出生体质量2.55 kg，出生7 d发病，表现为吃奶差，反应性差；血串联质谱(MSMS)：总亮氨酸(LEU+ILE+PRO-OH) 1 609.43 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 32.11，缬氨酸(VAL) 28.16 μmol/L；未行尿液串联质谱(GC-MS)检测；于2岁1个月死亡。患儿2(P2)，男，40周+3，顺产，出生体质量3.08 kg，出生4 d发病，表现为嗜睡，呛奶，反应性差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 2 360.96 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 104.33，VAL 351.46 μmol/L；尿GC-MS：2-羟基异戊酸35.7，2-酮-异戊酸5.5，2-酮-3-甲基戊酸14.3，2-酮-异己酸8.5；于出生21 d死亡。患儿3(P3)，女，36周+2，剖宫产，出生体质量2.85 kg，出生6 d发病，表现为反应性差，吃奶差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 2 419.1 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 49.42，VAL 688.26 μmol/L；尿GC-MS：2-羟基异戊酸159.1，2-酮-异戊酸90.1，2-酮-3-甲基戊酸196.6，2-酮-异己酸178.1；于出生22 d死亡。患儿4(P4)，女，41周+2，顺产，出生体质量3.55 kg，出生7 d发病，表现为嗜睡，反应性差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 3 392.14 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 70.3，VAL 1 080.17 μmol/L；尿GC-MS：2-羟基异戊酸7.7，2-酮-异戊酸3.1，2-酮-3-甲基戊酸9.5，2-酮-异己酸34.2；患儿自确诊后接受治疗与随访，出生10个月，生长发育落后，肌张力低，竖头不稳，尖足，眼神呆滞。患儿5(P5)，男，38周+2，剖宫产，出生体质量3.5 kg，出生7 d发病，表现为拒乳，反应性差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 3 238.76 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 60.5，VAL 549.9 μmol/L；尿GC-MS：2-羟基异戊酸19.59，2-酮-异戊酸32.4，2-酮-3-甲基戊酸5.4，2-酮-异己酸7.2；患儿自确诊后接受治疗和随访，出生10个月，生长发育基本正常，双侧下肢肌张力低，认母，可逗笑，能与人交流。5例患儿父母表型均正常。患儿父母均签署知情同意书，研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 基因测序 采用二代高通量测序技术。采集患儿外周血2 mL，外送金域临床检测中心进行高通量测序分析。采用QIAampDNA提取试剂盒(QIAGEN公司)抽提基因组DNA，将DNA随机打断纯化，进行扩增并连接接头序列，经过捕获、纯化及再扩增获得基因文库。针对BCKDHA的9个外显子，BCKDHB的10个外显子，DBT的11个外显子、DLD的14个外显子进行高通量测序。检测结果用BWA算法与GenBank BCKDHA(NM-000709)、BCKDHB(NM-183050)、DBT(NM-001918)、DLD(NM-000108)参考序列比较，获得可疑的突变位点，并进行父母验证证实突变来源。

1.3 突变位点生物学信息分析 采用PolyPhen2[1]、Mutation Taster[2]及SPANR[3]软件预测突变对蛋白质结构及功能的影响; SWISS-MODEL软件建模，BCKDHA突变的模板为2bff.1.A[4]，BCKDHB突变的模板为1olx.1.B[5]。PDB软件分析氨基酸残基的功能变化[6]，参考PDB代码为1X7Y[7]。

2 结果

2.1 测序及父母验证结果 结果显示P1的BCKDHA携带c.940C>T及c.992dupA复合杂合突变，且分别来自患儿父母；P2的BCKDHB携带c.853C>T及c.1039-3C>A复合杂合突变，且分别来自患儿父母；P3的BCKDHB携带c.1046G>A及c.550delT复合杂合突变，且分别来自患儿父母；P4的BCKDHB携带c.383G>A及c.490G>A复合杂合突变，且分别来自患儿父母；P5的BCKDHB携带c.410C>T杂合突变，来自患儿母亲。DBT和DLD未发现突变。其中c.1039-3C>A突变为内含子突变，其余突变均发生在外显子区域。经过检索SNP、ExAC及1000G数据库c.940C>T、c.853C>T、c.410C>T被ExAC收录，具有SNP代码；c.1046G>A具有SNP代码；c.383G>A、c.940C>T虽被报道但未被以上数据库收录；c.550delT为本研究首次发现；c.992dupA、c.1039-3C>A为首次报道的新突变。

2.2 计算机软件分析结果

2.2.1 突变位点保守性分析结果 除P2 c.1039-3C>A发生在内含子外，其他突变均发生在高度保守的外显子区域，见表1。PolyPhen2和Mutation taster两种软件得分越接近1越预示突变位点为保守位点，突变可能导致蛋白功能的改变而致病；SPANR适用于剪接错误突变的预测，当Dpsi_Percentile得分小于3分时认为能够引起剪接突变而致病。另外，c.940C>T和c.853C>T突变导致蛋白质编码提前终止，截短蛋白的产生必然发生剪接错误因此Dpsi_Percentile得分偏低。

表1 5例患儿基因突变情况及软件预测结果

2.2.2 建模及PBD分析结果 P1 BCKDHA基因c.940C>T导致蛋白质水平p.R314*改变，编码产生的截短蛋白比野生型减少132个氨基酸；c.992dupA导致蛋白质水平p.Y331*改变，编码产生的截短蛋白较野生型减少115个氨基酸。PBD二级结构显示p.R314*改变使得编码蛋白丢失9个α螺旋，2个β链和2个β转角；p.Y331*改变使得编码蛋白丢失8个α螺旋，1个β链和2个β转角。P2 BCKDHB基因c.853C>T导致蛋白水平p.R285*改变，编码产生的截短蛋白较野生型减少108个氨基酸。二级结构显示蛋白丢失6个α螺旋，4个β链。P3 BCKDHB基因c.550delT突变导致p.S184Pfs*46读码框移位，编码产生的截短蛋白较野生型减少164个氨基酸，二级结构显示蛋白丢失10个α螺旋、1个β转角、11个β折叠；P3 BCKDHB基因c.1046G>A错义突变导致蛋白水平p.C349Y改变。P4 BCKDHB基因c.383G>A 错义突变导致蛋白质水平p.G128E改变；c.490G>A错义突变导致蛋白质水平p.A164T改变。P5 BCKDHB基因 c.410C>T错义突变导致蛋白质水平p.A137V的改变。这几个错义突变可能导致编码产生的蛋白于突变位点之后的二级结构丢失。

3 讨论

MSUD是一种罕见的隐形遗传代谢病，总体患病率约为1∶185 000，在近亲婚配率较高的阿拉伯和土耳其人群MSUD患病率较高[8～10]。我国由于MSMS开展的较晚，缺乏大数据统计，因此具体发病率不详。本研究青岛地区筛查24万新生儿确诊4例，门诊接诊外地患儿1例。MSUD的发病率虽然很低，但却是一种严重威胁患者生命健康的疾病，患者由于BCKD活性完全或部分缺乏导致亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸在体内蓄积，引发重度酮症酸中毒、神经功能损害、精神发育迟滞。2001年以前国内外对该病遗传学病因的研究报道认为突变有34%发生在BCKDHA(E1α基因)基因上；29%在BCKDHB(E1β基因)基因上；24%在E2基因上；13%在E3基因上[11]。2007年德国报道的30个突变基因中，37%在BCKDHA上，46%在BCKDHB上，13%在E2基因上[12]。2013年Narayanan等[13]报道的印度南部地区发生在BCKDHA上和BCKDHB上突变均占46%，DBT基因突变占14%。由此可见BCKDHA和BCKDHB是MSUD患儿的主要突变基因，而E3基因的突变极为少见。本文报道的5例患儿中1例为BCKDHA突变导致，4例为BCKDHB突变导致，结合文献报道中国发病情况[14～21]，其发病基因的比例为BCKDHB占60%，BCKDHA占28%，DBT占12%，E3未见。

本文报道的9个突变位点中c.940C>T、c.853C>T、c.1046G>A、c.383G>A、c.490G>A、c.410C>T均已报道过。c.550delT位点为本研究首次发现;c.992dupA、c.1039-3C>A为首次报道突变。本文重点讨论新突变位点对蛋白质结构与功能的影响。位于BCKDHA基因第7外显子的c.992dupA突变导致蛋白质水平p.Y331*改变，编码产生的截短蛋白较野生型减少115个氨基酸。丢失的二级结构中包含THDP辅助因子的连接位点336H[4]。由于BCKD结构的稳定性取决于THDP辅助因子和钾离子的存在[22]，因此上述突变将明显改变E1α以及与之相连接的E1β的空间结构及功能。另外，由于突变导致编码终止信号提前出现在第7外显子上，很有可能导致无义介导的mRNA降解(NMD)，导致相对明确的功能丢失[23]。c.1039-3位于BCKDHB基因上最后一个外显子5′端的剪接位点受体上，突变导致剪接位点受体丢失，由于人类剪接规律依照GU-AG规则，当剪接位点受体丢失可能导致剪接方式发生改变从而使得外显子变长，编码产生加长蛋白产物,也可引发NMD的发生导致蛋白功能丢失而致病。

MSUD患儿临床结局与BCKD的活性密切相关。75%的经典型MSUD患者其BCKD的活性仅为正常人的0～2%，因此临床损害最为严重。由于缺乏BCKD活性的直接数据支持，我们初步对MSUD临床严重程度与基因突变类型的关系进行了探讨。目前MSUD严重程度与遗传学病因的关系并不明确[24]。理论上，纯合子突变更容易揭示突变与临床表现的关系，但就目前的报道来看，除了近亲婚配率高的人群纯合突变率较高外，大多数患者为复合杂合突变。本文的5例MSUD患儿中有4例为复合杂合突变，1例为单杂合突变。该5例患儿虽然均被诊断为经典型MSUD,但临床表现严重程度不一。5例患儿均在出生后7 d内发病，P1血中支链氨基酸以亮氨酸为主，缬氨酸升高不明显，一直在门诊接受治疗；2岁1个月时由于重度酸中毒昏迷家长放弃治疗而死亡。P2至P5血中总亮氨酸和缬氨酸水平均远高于正常水平。P2和P3虽经过积极治疗但是由于一直无法建立自主呼吸且长期昏迷家长放弃治疗于生后20 d左右死亡。P4确诊后早期进行了规范治疗但是由于家长配合性差，患儿脑部磁共振检查显示颅内多发异常信号神经系统不可逆受损，且生长发育落后。P5虽然初期脑部神经系统存在异常信号但经过规范治疗及监测，10个月大查体患儿虽双侧下肢肌张力低下，但俯卧位抬头稳，会逗笑，能与人交流，认母偶有咿呀儿语，生长发育基本正常。P1至P3临床损害严重，分析其基因突变类型发现3例患儿均存在翻译提前终止的突变，截短蛋白及NMD机制的发生，导致mRNA降解，BCKD活性完全缺失可能是临床损害严重的机制。P5虽仅检测到一个杂合突变c.410C>T，但是结合患者血串联结果、尿GC-MS结果和临床表现诊断为经典型MSUD。Nellis等[25]曾报道携带c.410C>T突变的淋巴细胞BCKD无活性，根据MSUD的遗传规律不排除该患儿存在其他致病突变。一代测序以及MLPA技术可以进一步针对内含子和缺失重复突变进行检测帮助寻找遗传学病因。MSUD多发于新生儿，早期诊断早期干预对提高患儿生命质量至关重要[26]。

本研究选择5例MSUD病例，并分析了新发现突变位点的致病性，明确了MSUD患儿的遗传学病因。此5例MSUD病例突变基因的报道有利于世界MSUD基因热点突变的统计，同时新位点的发现丰富了BCKDHA基因和BCKDHB基因的突变谱，为MSUD的诊断和治疗以及产前诊断提供依据。