李佳赟，马 进，王依纯，朱绍华

(浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 临安 311300)

日益加剧的土壤盐碱化已成为影响农业可持续发展的主要危害因子，预计到2050年，全球将会有1/2的耕地盐碱化[1-2]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)根系发达且具有根瘤菌，固氮能力强，能够快速使海涂覆绿，加快海涂生物治理脱盐，提高土壤肥力，改善海涂生态环境，可作为一种新的围垦海涂的改良先锋绿化植物，开发出更多的土地后备资源，实现耕地占补平衡。从国外引进的高秋眠级紫花苜蓿品种表现出产量高、品质好和再生快等特点，但其耐盐能力有限，无法在南方沿海滩涂盐碱地大规模种植。利用现代生物学技术，创制南方型紫花苜蓿耐盐新种质，是培育耐盐碱海涂种植紫花苜蓿新品种的根本途径，而明确南方型紫花苜蓿盐胁迫应答的调控机制是首要前提。

近年来，植物耐盐有关方面的研究越来越受到重视。据报道，植物在应对盐胁迫时，叶片中的脯氨酸含量明显上升[3-6]。盐处理下，光叶漆(RhusglabraL.)等树种的树高、生长量和生物量积累均有不同程度的下降，且盐浓度越高，降幅越大[7]。另外，由于植物耐盐性属于复杂的数量遗传性状，单纯从基因或蛋白质水平上研究具有片面性，因为基因与蛋白质水平上的变化并不一致，而蛋白质合成后的各种修饰往往会带来细胞活性的改变[8-9]。植物在响应和适应盐胁迫的过程中，需要不断调节自身复杂的代谢网络来维持系统内部的动态平衡。为明确紫花苜蓿响应盐胁迫的代谢途径，以南方型紫花苜蓿野生型和耐盐突变体为材料，测定盐胁迫下野生型与突变体紫花苜蓿的根长、株高、生物量积累以及叶片的代谢产物，绘制紫花苜蓿叶片的代谢通道，分析盐胁迫下野生型与突变体紫花苜蓿叶片的代谢产物差异，从代谢组水平上明确紫花苜蓿叶片对盐胁迫的响应机制。

1 材料和方法

1.1 试验材料与处理

以南方型紫花苜蓿品种Millennium野生型(Wild type,WT)为材料，通过以NaCl为选择因子对长期继代培养的紫花苜蓿愈伤组织进行选择，筛选出耐1.2% NaCl的耐盐细胞系，经生理检测为体细胞无性系突变体(Mutant,MT)紫花苜蓿[10]，经过3代自交，进行抗盐性鉴定筛选，发现该突变体耐盐性可以稳定遗传，以该突变体的T4代为材料进行研究。

将紫花苜蓿突变体和野生型种子置于培养皿中，于20 ℃生长箱内发芽。5 d后，将种子发芽后的小苗转移至装满细沙和珍珠岩(体积比3∶1)的塑料盆中。用1/2Hoagland营养液培养4周后，各取野生型和突变体12盆进行试验。以添加250 mmol/L NaCl的1/2Hoagland 营养液进行培养作为盐胁迫处理(NS)，以1/2Hoagland营养液继续培养作为对照(CK)。处理72 h后，从每个处理每个材料中随机取3盆测定生长指标；另取每个处理每个材料剩余的3盆，分别采收紫花苜蓿叶片，混合后于液氮中冷冻，-80 ℃保存备用，用于代谢产物的提取。

1.2 生长指标测定

分别对野生型和突变体紫花苜蓿的株高(cm)进行测量，然后将植株的地上部和地下部分开，用蒸馏水多次冲洗根系直至干净，并将根系水分吸干，测量植株的根长(cm)。最后，将植株的地上部和地下部放入烘箱120 ℃杀青30 min，然后80 ℃烘干至恒质量，测量地上部和地下部的干质量(g)。

1.3 代谢产物提取和鉴定

分别取CK和盐处理叶片组织样品(50 mg)转移至1.5 mL EP管(Eppendorf Micro Test Tubes，Eppendorf China Limited，Shanghai City，China)，先加入0.5 mL提取液(V甲醇∶V氯仿= 3∶1)，再加入60 μL核糖醇(0.2 mg/mL保存于dH2O)作为内标，漩涡混匀，然后使用热混合仪于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取出0.4 mL上清液转移到2 mL GC-MS玻璃小瓶中作为新样品。将80 μL甲氧基胺化试剂(20 mg/mL吡啶溶液)加入到新样品中，涡旋10 s，在真空浓缩器中干燥，并置于37 ℃烘箱2 h。之 后，向每个样品中加入0.1 mL BSTFA试剂(含1%TMCS，V/V)，70 ℃振荡1 h。当所有样品的温度降至室温时，通过气相色谱和飞行时间质谱联用进行GC-MS分析。最后，将归一化的数据导入Simca-P软件，釆用PLS-DA(Partial least squares-discriminant analysis)模型第一主成分的VIP值(>1)并结合Student’st-test检验的P值(阈值0.05)寻找差异表达代谢产物，用MST商业数据库鉴定各种代谢产物。

1.4 数据分析和代谢网络的构建

采用多元变量统计分析方法(PCA、PLS-DA、OPLS-DA)对代谢产物进行分析，不同处理代谢产物的差异用t检验和ANOVA进行分析。利用Metaboanalyst进行代谢途径检索，选择拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、百脉根(Lotuscorniculatus)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等相关代谢数据库进行比对，并参考KEGG代谢数据库绘制代谢通路。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下野生型和突变体紫花苜蓿的生长变化

表1表明，与CK相比，盐胁迫下突变体和野生型紫花苜蓿株高、根长、地上和地下部干质量均下降，其中,野生型紫花苜蓿地上和地下部干质量降幅最大。同时，盐胁迫下突变体紫花苜蓿地上和地下部干质量、株高、根长的降幅小于野生型。

表1 盐胁迫对野生型和突变体紫花苜蓿生长的影响

2.2 盐胁迫下野生型和突变体紫花苜蓿叶片代谢图谱的主成分分析(PCA)

利用SIMCA-P软件，将盐胁迫72 h处理组和CK组紫花苜蓿叶片的代谢产物数据进行对数转换处理，然后进行自动建模，同时利用正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)的统计方法对结果进行PCA分析(图1)，以反映野生型和突变体紫花苜蓿叶片代谢图谱中的相似性和差异性。

WS、MS分别表示盐处理下野生型、突变体紫花苜蓿叶片，WC、MC分别表示对照处理下野生型、突变体紫花苜蓿叶片

由图1可知，盐胁迫下野生型与突变体紫花苜蓿叶片在PC1上有明显分离，PC1的贡献率为38.4%，而PC2贡献率则为25.5%，表明野生型与突变体紫花苜蓿叶片的代谢调控不同。因此，对代谢产物进一步分析，构建出代谢通路，可揭示紫花苜蓿叶片的耐盐调控机制。

2.3 盐胁迫下野生型和突变体紫花苜蓿叶片差异代谢产物分析

基于气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF/MS)代谢组数据的固有特性，使用多元变量统计分析方法对数据进行分析，通过比较野生型和突变体紫花苜蓿叶片在盐胁迫下的差异代谢产物，探讨紫花苜蓿叶片在盐胁迫下代谢途径的变化。通过数学统计分析及筛选(P<0.05，VIP>1)，从极性提取物中筛选出差异代谢产物，野生型和突变体紫花苜蓿叶片中共筛选出41种重叠的差异代谢产物。由表2可见，41种共同差异代谢产物中，盐胁迫处理下突变体叶片中有25种上调，16种下调，尤其是氨基酸类代谢产物，上调的有11种；而盐胁迫处理下野生型叶片中有18种上调，23种下调，其上调的代谢产物主要是有机酸。与CK相比，盐胁迫下野生型叶片中脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸含量增加，而甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸、亮氨酸、β-丙氨酸含量降低；突变体叶片中除赖氨酸含量较CK降低外，其他氨基酸的含量均增加。与CK相比，盐胁迫下野生型叶片中苹果酸含量显著下降，而柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、异柠檬酸、马来酸含量显著增加；盐胁迫下突变体叶片中富马酸和异柠檬酸含量较CK极显著增加外，其他有机酸含量均下降。与CK相比，盐胁迫下野生型叶片中月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸和肉豆蔻酸含量均明显下降，突变体叶片中月桂酸和硬脂酸含量增加，其他脂肪酸含量均下降。与CK相比，盐胁迫下野生型叶片中半乳糖、果糖-6-磷酸和磷酸烯醇含量增加，而甘露糖、木糖、海藻糖、肌醇、Myo-肌醇、麦芽糖、6-磷酸葡萄糖和葡萄糖含量下降；盐胁迫下突变体叶片中甘露糖、半乳糖、肌醇、Myo-肌醇和果糖-6-磷酸含量显著或极显著增加，而木糖、海藻糖、麦芽糖、6-磷酸葡萄糖、葡萄糖和磷酸烯醇含量降低。

表2 盐胁迫下野生型与突变体紫花苜蓿叶片代谢产物的变化Tab.2 Metabolic profile changes in leaves of wild-type and mutant alfalfa after salt stress μmol/g

注：*、**分别表示盐处理和CK差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)。

Note:* and ** indicate that the difference between the salt treatment and the control was significant(P<0.05) and extremely significant(P<0.01).

2.4 盐胁迫下野生型和突变体紫花苜蓿叶片代谢产物的代谢通路分析

对所得代谢产物与KEGG数据库进行比对发现，野生型与突变体紫花苜蓿叶片代谢产物主要集中在氨基酸生物合成、氨酰-tRNA生物合成、三羧酸(TCA)循环、半乳糖代谢过程中(图2)。有11个氨基酸、7个糖、2个糖醇和5个有机酸参与了糖酵解、氨基酸合成和TCA循环。通过对代谢产物和代谢通路进行整合分析，发现盐胁迫下野生型紫花苜蓿叶片中参与TCA循环的柠檬酸、富马酸、α-酮戊二酸、马来酸、琥珀酸含量与CK相比显著上调，甘露糖、葡萄糖、木糖、海藻糖、麦芽糖显著下调；盐胁迫下突变体紫花苜蓿叶片中丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、β-丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、谷氨酸、脯氨酸和Myo-肌醇含量显著上调。

A表示野生型紫花苜蓿叶片盐处理/CK；B表示突变体紫花苜蓿叶片盐处理/CK；黑色和灰色框分别表示代谢产物显著上调和下调(VIP>1，P<0.05)；白色框表示代谢产物无显著变化

3 结论与讨论

盐胁迫下植物会受到不同程度的伤害，其生物量变化反映盐胁迫对植物的影响，同时也是衡量植物耐盐性的直接指标。研究表明，随着土壤盐度升高，高粱(Sorghumbicolor)等植物生长受到抑制[11-16]。本研究结果显示，与CK相比，盐胁迫后野生型和突变体紫花苜蓿的株高、根长、地上和地下部干质量降低，这说明盐胁迫对野生型和突变体紫花苜蓿的生长均有抑制作用，但盐胁迫下，野生型紫花苜蓿的株高、根长及地上地下干质量等生长参数的降幅大于突变体，说明突变体对盐胁迫具有较好的适应性，表现出较强的耐盐性。

植物在受到盐胁迫时，为了调节细胞质与环境之间的渗透压，体内会积累一些小分子物质来降低水势，这些小分子物质被称为渗透调节物质[17]，主要包括有机酸、氨基酸、脂肪酸、糖及多元醇等代谢产物[18]。研究表明，盐胁迫下，植物体内的葡萄糖、果糖、蔗糖等可溶性糖含量升高[19-20]，这可能是因为植物通过调节细胞内的渗透势来保护细胞结构完整，从而更好地应对盐胁迫带来的伤害[21]。此外，多元醇、甲基衍生物松醇和肌醇也被公认为是渗透调节物，并且在胁迫条件下显著积累，在植物响应逆境胁迫时发挥一定的作用[22-25]。本研究结果显示，与CK相比，盐胁迫下野生型紫花苜蓿叶片中半乳糖和果糖-6-磷酸含量上升，其他可溶性糖和肌醇含量均有所下降。野生型紫花苜蓿并不是通过增加可溶性糖和肌醇类渗透调节物质来适应盐胁迫。与CK相比，盐胁迫下突变体紫花苜蓿叶片则积累更多的肌醇、甘露糖、半乳糖等渗透调节物质。氨基酸既能合成蛋白质，又是植物应对环境胁迫时产生相关代谢产物的前体[26]。研究证实，盐胁迫下，脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸等氨基酸含量增加可减轻荷花(Nelumbonucifera)受到盐胁迫的伤害[27]。本研究发现，与CK相比，盐胁迫下野生型和突变体紫花苜蓿叶片中脯氨酸和苏氨酸含量显著上升，但突变体紫花苜蓿叶片中积累的氨基酸总量比野生型积累得更多。可见，突变体紫花苜蓿叶片可通过积累更多的氨基酸、肌醇、甘露糖、半乳糖等渗透调节物质来增强对盐胁迫的适应性。

在应对逆境胁迫时，参与植物体内物质和能量代谢的有机酸含量会发生变化，植物在正常生长环境中，体内有机酸含量很低，而在响应盐胁迫逆境时有机酸含量则会升高，但不会对植物细胞造成伤害[28]。本研究发现，与CK相比，盐胁迫下野生型紫花苜蓿叶片中参与TCA循环的柠檬酸、富马酸、α-酮戊二酸和琥珀酸含量显著上调，表明TCA循环增强。而葡萄糖、甘露糖、木糖等含量显著下降，这表明野生型紫花苜蓿叶片中一些糖含量的降低，可能使碳水化合物的合成受到抑制，让更多糖类流入TCA循环中，从而适应盐胁迫。同时，与CK相比，盐胁迫下突变体叶片中参与TCA循环的柠檬酸、α-酮戊二酸、马来酸和琥珀酸含量减少。表明突变体紫花苜蓿响应盐胁迫时与TCA循环并无明显关系。

脂肪酸是植物细胞膜的重要组成成分，盐胁迫下植物细胞结构受到破坏，细胞内容物大量溢出，造成脂肪酸含量降低[29]。研究表明，生物通过脂肪酸脱饱和维持膜的流动性来适应外界环境变化，而脂肪酸和质膜是植物应对盐胁迫响应时的重要物质[30]。本研究发现，与CK相比，盐胁迫下野生型紫花苜蓿叶片中脂肪酸含量不仅没有增加反而出现下降的现象，而盐胁迫下突变体叶片中除月桂酸、硬脂酸外，其他脂肪酸的含量都有不同程度下降，这说明脂肪酸含量的降低可能是紫花苜蓿响应盐胁迫的一种适应性策略。

综上，盐胁迫对突变体紫花苜蓿生长的抑制作用明显低于野生型紫花苜蓿，说明突变体紫花苜蓿比野生型紫花苜蓿具有更高的耐盐性。盐胁迫下，野生型紫花苜蓿叶片中的差异代谢产物有18种上调、23种下调，而突变体叶片中则有25种上调、16种下调。与CK相比，盐胁迫下野生型紫花苜蓿叶片中葡萄糖、甘露糖、木糖等可溶性糖和脂肪酸含量下降，而突变体叶片中脯氨酸、谷氨酸、肌醇和甘露糖等有机化合物含量上升，说明野生型与突变体紫花苜蓿叶片的耐盐机制明显不同。野生型紫花苜蓿可能是通过加强TCA循环释放出更多的ATP来应对盐胁迫，而突变体紫花苜蓿则通过减少ATP的消耗，积累较多的渗透物质(脯氨酸、糖、肌醇)来增强其耐盐性。