李聪聪，叶连萌，卢 涛， 吴 姣，徐秋良，宋素芳，李婉涛

(1.河南牧业经济学院 动物科技学院，河南 郑州 450046； 2.河南省畜禽遗传资源保护工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

疾病发生是我国生猪养殖业一直存在的问题，且近几年呈现出日益严重的趋势。目前，猪的疾病种类很多，并且表现出复杂化和典型化现象，给生猪养殖业带来巨大危害。其中，病毒性疾病传播速度快，病猪的死亡率高，防控形势严峻。病毒能够寄宿在宿主细胞内进行生存和繁殖，不易被消除，并且病毒的遗传物质极易发生突变，普通疫苗的防控难度大。因此，亟须深入探索与病毒致病相关的信号通路及其基因的调控机制，从而找到治疗猪病毒病的新思路。

巨噬细胞是动物机体内一类重要的免疫细胞，在固有免疫和适应性免疫中均发挥重要作用。当猪受到病毒(例如猪蓝耳病毒)感染后，首先被影响的便是巨噬细胞(例如肺泡巨噬细胞)。有数据表明，感染猪蓝耳病毒后，猪体内巨噬细胞的功能会受到抑制，形成严重的免疫抑制反应，从而导致猪体对其他病毒性和细菌性疾病的易感性明显增加[1]。

宿主细胞的抗病毒作用主要是Toll受体3(Toll-like receptor 3，TLR3)与病毒双链RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)两者的特异性作用，其作用机制大致有2类：第一，当dsRNA与TLR3特异性结合后，会进入胞内并引起干扰素等抗病毒细胞因子的活化，从而抑制病毒的复制；第二，当dsRNA与TLR3特异性结合后，会激活特异性的RNA酶，从而分解病毒的RNA，以调控非特异性抗病毒反应[2]。朱博等[3]研究表明，TLR3能够同时介导2种免疫反应：TLR3能够识别dsRNA并发生天然的抗病毒免疫反应；TLR3通过活化髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)蛋白，并介导共刺激分子CD86、CD80等其他细胞因子的表达，继而发生炎症反应。TLR3可通过MyD88非依赖/TRIF依赖型信号转导通路诱导产生Ⅰ型干扰素(Interferon，IFN)，其中β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon β，TRIF)是TLR3介导的MyD88非依赖信号通路中的关键蛋白[4]。当TLR3识别dsRNA后，通过TRIF衔接蛋白促进TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)和IKK激酶ε(Inhibitor-κB kinase ε，IKKε)等转录因子的生成，从而激活干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3，IRF3)[5-8]，进而诱导共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达[9-13]。

本研究使用Poly(I：C)模拟病毒，刺激体外培养的猪肺泡巨噬细胞(3D4/21细胞)，设计不同的处理时间，观察3D4/21细胞形态的变化，采用qPCR方法检测TLR3基因及其信号通路相关基因表达量的变化，探讨3D4/21细胞在Poly(I：C)刺激下发生的免疫应答分子机制，旨在为猪病毒性疾病的抗病工作提供新的方法和思路。

1 材料和方法

1.1 试验材料

Poly(I：C)(tlrl-pic-5)购自InvivoGen公司。将50 mL无菌Poly(I：C)稀释液PBS(购自Gibco公司)与50 mg的Poly(I：C)粉末加入锥形瓶中,完全稀释至1 mg/mL，分装后保存于-20 ℃备用。

1.2 3D4/21细胞培养及Poly(I：C)刺激

10%的FBS和89%的1640培养基以及1%的MEM非必需氨基酸溶液(MEM-NEAA)构成了培养3D4/21细胞(由华中农业大学赵书红课题组惠赠)的完全培养基，其中FBS、1640培养基和MEM-NEAA均购自Gibco公司。将细胞置于5% CO2、饱和湿度的37 ℃恒温培养箱中培养，待细胞汇合度达到90%左右时，用25 μg/mL[14]的Poly(I：C)进行刺激，分别在刺激4、8、12、24 h时用倒置显微镜观察3D4/21细胞形态并于拍照后收集细胞，同时以加入等量稀释液PBS的3D4/21细胞作为阴性对照，每组设置3个重复。

1.3 3D4/21细胞的总RNA提取、反转录及qPCR

利用Trizol(购自Invitrogen公司)提取细胞的总RNA，并用NanoDrop 1000(购自Invitrogen公司)测定质量浓度，并记录每个样品的总RNA质量浓度和OD260/OD280值。每个样品取2 μg，加入RNA变性Loading Buffer[15]，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，检测28S rRNA、18S rRNA以及5.8S rRNA条带的完整性。

用DNaseⅠ(购自Invitrogen公司)对提取的总RNA去除基因组DNA，按照反转录试剂盒K1622(购自Invitrogen公司)的操作步骤进行反转录，反转录结束后，将cDNA置于-20 ℃保存备用。

以所得cDNA为模板，对TLR3、IRF3、CD86、IFNα基因的表达量进行检测分析，各基因检测引物见表1，引物由上海生工生物工程有限公司进行合成。10 μL的反应体系：5 μL 2×SYBR®Green Real-time PCR Master Mix(购自Toyobo公司)，25 pmol引物，50 ng模板cDNA，补水至10 μL。利用ABI7500 Fast系统进行实时荧光定量PCR检测。扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

表1 定量PCR引物信息Tab.1 The information of primers for qPCR

1.4 数据处理

qPCR数据用相对定量2-ΔΔCt法进行分析[18]，GAPDH作为内参基因对各基因表达水平进行校正。t检验分析数据差异显著性，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 Poly(I：C)刺激下不同处理时间3D4/21细胞形态变化

如图1所示，对照组的3D4/21细胞均呈现椭圆形和不规则形状，胞内浆液较为丰富，且细胞呈现均匀密集分布，贴壁良好。但在Poly(I：C)刺激下，4 h时试验组的3D4/21细胞大部分为贴壁细胞，大多数仍呈椭圆形，只有少量的圆形死细胞出现；8 h时试验组的3D4/21细胞密度增大，圆形死细胞的数量开始增多；12 h时试验组的3D4/21细胞发生形态变化，出现较多菱形、星形的细胞，还有少部分细胞出现伪足和突起；24 h时试验组的大部分3D4/21细胞出现清晰的伪足和突起，且出现大量的圆形死细胞，并且随着处理时间的延长，试验组死细胞越来越多。

图1 Poly(I：C)刺激下不同处理时间3D4/21细胞的形态(×100)Fig.1 The morphological changes of the 3D4/21 cells after stimulation with Poly(I：C) (×100)

2.2 3D4/21细胞总RNA的提取及质量检测

琼脂糖凝胶电泳检测提取的3D4/21细胞总RNA，共显示出3条亮带(28S rRNA、18S rRNA和5.8S rRNA)，其中28S rRNA条带亮度接近18S rRNA条带亮度的2倍，并且点样孔附近没有其他条带的出现(图2)，说明所获得的细胞总RNA完整性及质量良好。

图2 3D4/21细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳(部分)Fig.2 Total RNA agarose gel electrophoresis of 3D4/21 cells (Section)

2.3 Poly(I：C)刺激下3D4/21细胞中TLR3基因及其信号通路相关基因表达量变化

在Poly(I：C)刺激下，4个处理时间中试验组TLR3基因和IRF3基因的表达量均呈现先下调后上调趋势。与对照组相比，在4 h和8 h时，试验组TLR3基因表达量与对照组无显著差异；在12 h时，试验组TLR3基因的表达量是对照组的1.63倍，且差异显著(P<0.05)；在24 h时，试验组TLR3基因的表达量最高，是对照组的2.77倍，且差异显著(P<0.05)(图3)；在4个处理时间中，试验组IRF3基因的表达量均高于对照组，但差异均不显著(图3)。在Poly(I：C)刺激下，4个处理时间中试验组IFNα基因的表达量呈上调趋势。与对照组相比，4 h时试验组IFNα基因的表达量略有上升，但差异不显著；在8 h和12 h时，试验组IFNα基因的表达量分别是对照组的1.84倍和2.14倍，且差异显著(P<0.05)；在24 h时，试验组IFNα基因的表达量最高，是对照组的2.91倍，且差异显著(P<0.05)(图3)。在Poly(I：C)刺激下，4个处理时间中试验组CD86基因的表达量呈先上调后下调的趋势，在4、8、12 h时，试验组CD86基因表达量均较对照组大幅度上升。在4 h时，CD86基因的表达量是对照组的4.70倍，差异显著(P<0.05)；在8 h时，CD86基因的表达量是对照组的7.92倍，差异极显著(P<0.01)；在12 h时，CD86基因的表达量最高，是对照组的17.60倍，差异极显著(P<0.01)；但在24 h时，试验组CD86基因的表达量较8 h和12 h呈现下调趋势，并且其表达量是对照组的6.00倍，差异极显著(P<0.01)(图3)。以上数据表明，当Poly(I：C)刺激3D4/21细胞时，能够诱导TLR3基因及其信号通路相关基因的表达量发生变化，其中TLR3和IRF3基因表达趋势均呈现波动上调，IFNα基因呈现持续上调的趋势，而CD86基因的表达则表现为先上调后下调的趋势。

*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)

3 结论与讨论

3.1 Poly(I：C)刺激下3D4/21细胞形态的变化

一般情况下，3D4/21细胞呈现椭圆形或不规则形态，在dsRNA刺激下，3D4/21细胞会随着处理时间的延长发生悬浮，最终变为死细胞，此时3D4/21细胞形态主要呈现圆形，被Poly(I：C)刺激后的3D4/21细胞形态会随着处理时间的推移，发生相应的变化[18]。最初，细胞主要呈现椭圆形或不规则形状，且胞浆丰富[19]；用Poly(I：C)刺激4 h后，3D4/21细胞的贴壁性良好，但随着处理时间的延长，细胞密度会逐渐增大并出现钝形伪足和突起。杨志梅等[20]报道，在一定剂量的病毒刺激下，随着时间的推移3D4/21细胞会变圆死亡，且在24 h时死亡数量最多，与本研究结果一致。

3.2 Poly(I：C)刺激下TLR3基因及其信号通路相关基因表达量的变化

本研究中，试验组受体基因TLR3和IRF3基因均呈现波动上调趋势，均在24 h达到最高表达量，在24 h时，试验组TLR3和IRF3基因的表达量分别是对照组的2.77倍和1.42倍；细胞因子IFNα基因的表达量于4个处理时间呈上调趋势，在24 h时，试验组IFNα基因的表达量是对照组的2.91倍；共刺激分子CD86的表达量于4个处理时间呈先上调后下调的趋势，在12 h时，试验组CD86基因的表达量是对照组的17.60倍。

王继英等[17]设置4种Poly(I：C)质量浓度(0、10、20、40 μg/mL)和4个处理时间(4、8、12、24 h)对猪的外周血单核细胞进行刺激，检测TLR3、IRF3、IFNα基因的表达水平变化发现，在Poly(I:C)质量浓度为20～40 μg/mL时，TLR3和IRF3基因的表达量随处理时间的延长逐渐增加，并在刺激24 h时的表达量最高，与本研究测定结果一致；在Poly(I：C)刺激4 h时IFNα基因的表达量最高，但随着处理时间的延长其表达量逐渐降低，本研究中，IFNα基因的表达量在刺激24 h时达到最高，推测原因可能是单核细胞与3D4/21细胞类型的差异造成，并且供试Poly(I：C)可能也存在一定的差异。王彦平等[16]用20 μg/mL的Poly(I：C)刺激长白猪的外周血单核细胞24 h，检测免疫应答过程中相关基因的表达变化，结果表明，TLR3和IFNα基因表达量均上调，但变化不大，刺激组的IRF3基因表达量较对照组下调，而本研究中，IRF3基因的表达量波动上调，但差异不显著(P>0.05)，推测可能的原因是细胞类型不同，且细胞来源存在个体差异。王海飞[21]用20 μg/mL的Poly(I：C)刺激长白猪的外周血单核细胞，分别选择0、4、8、12、24 h为处理时间，检测免疫应答过程中相关基因的表达水平变化，结果表明，在Poly(I：C)刺激24 h时，TLR3和IRF3基因的表达量达到最高，与本研究结果一致；在Poly(I∶C)刺激4 h时，IFNα基因的表达量最高，随后逐渐降低，而在本研究中，IFNα基因的表达量在Poly(I：C)刺激24 h时最高，与对照组相比差异显著(P<0.05)。王冬梅等[22]用100 μg/L的Poly(I：C)与200个TCID50的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM细胞)，分别在12、24、36、48 h时检测IRF3基因的表达量发现，12 h时IRF3基因的表达量最高，但在本研究中，IRF3基因的表达量在12 h和24 h持续上调，推测原因可能是PRRSV存在一定的作用。WANG等[23]用1 μg/mL的Poly(I：C)刺激鸡胚成纤维细胞(CEFs)，并分别于2、6、12、20 h时检测IRF3基因的表达水平发现，在Poly(I：C)刺激6 h时，IRF3基因表达量最高，随后IRF3基因的表达量下降。王冬梅等[24]用PRRSV感染PAM细胞1 h，而后用100 μg/mL的Poly(I：C)刺激细胞，继续培养12、24、36、48 h，收集细胞检测PAM细胞中的IFNα基因表达水平变化发现，刺激组与对照组相比，IFNα基因的表达量显著上调，证明PRRSV和Poly(I：C)刺激PAM细胞后均能促进IFNα基因的转录，与本研究结果一致。LI等[14]用25 μg/mL的Poly(I：C)刺激猪PK15细胞，并分别在0、4、12、24 h时进行检测发现，于Poly(I：C)刺激12 h前，CD86基因表达量基本无变化，但在24 h时表达量最高，而本研究中，在Poly(I：C)刺激12 h时，试验组CD86基因的表达量最高，但在24 h时其表达量较12 h时降低，与对照组相比差异均极显著(P<0.01)，推测原因可能是供试细胞的类型不同。综上所述，不同类型或不同来源的细胞对不同批次Poly(I：C)的耐受力不同，Poly(I：C)刺激的质量浓度和处理时间选择不同，另外还有个体差异的因素都会对结果产生影响。

本研究采用Poly(I：C)体外刺激3D4/21细胞，qPCR检测TLR3基因及其信号通路相关基因的表达量变化，结果发现，Poly(I：C)能够诱导TLR3、IRF3、IFNα和CD86基因的上调表达，表明猪体感染病毒时TLR3信号通路发挥了重要调控作用，为猪病毒病的抗病育种防治提供新的方法和策略。