吴畅 刘海玲 赵夫娟

[摘要]目的 分析子宫内膜样腺癌（EA）组织中错配修复蛋白（MMRP）和p53蛋白表达与临床病理特征的关系以及两者的相关性。方法 本研究中的所有标本取自2017年1月～2018年12月在中南大学湘雅医院确诊并进行手术治疗的EA患者。应用免疫组化Envision法检测162例EA患者中MMRP及p53蛋白的表达情况；将4种MMRP中的1种以上表达缺失定为微卫星不稳定组（MSI组），全部阳性表达设为微卫星稳定组（MSS组）。分析MMRP与p53的表达与临床病理特征的相关性以及两种蛋白之间的相关性。結果 162例中，MSS组120例，MSI组42例。MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达缺失率分别为3.7%、6.2%、10.5%及17.9%；其中共同缺失表达类型为MSH2-MSH6和MLH1-PMS2者分别为4例（2.5%）、15 例（9.3%）。MMRP表达情况在分化程度、浸润深度方面比较，差异有统计学意义（P<0.05）。p53表达在年龄、分化程度、浸润深度、淋巴结转移方面比较，差异有统计学意义（P<0.05）。经Spearman分析得出，MSI与p53成正相关 （r=0.189，P<0.05）。结论 在EA患者中存在MMRP缺失，且MLH1、PMS2缺失表达较MSH2和MSH6多见。MSI及p53与EA的临床病理特征关系密切，对EA的预测以及恶性程度的评估具有参考价值，且两者成正相关，可能参与EA的发生、发展过程。

[关键词]子宫内膜样腺癌；MSH2；MSH6；MLH1；PMS2；p53；免疫组织化学

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）4（a）-0008-04

[Abstract] Objective To analyze the relationship between the expression of mismatch repair protein （MMRP） and p53 protein in endometrial adenocarcinoma （EA） tissues and the clinicopathological characteristics and the correlation between the two proteins. Methods All specimens in this study were taken from patients who were diagnosed with EA and underwent surgical treatment at Xiangya Hospital of Central South University from January 2017 to December 2018. The expression of MMRP and p53 protein in EA （162 cases） was detected by immumohistochemistry method Envision. The microsatellite instability group （MSI group） was defined as the expression deficiency of more than one of the four MMRPS， and the microsatellite stability group （MSS group） was defined as all four kinds of MMRP positive expression. The correlation between the expression of MMRP and p53 and clinicopathological features and the correlation between the two proteins were analyzed. Results There were 120 cases in MSS group and 42 cases in MSI group in 162 cases. The expression deletion rate of MSH2， MSH6， MLH1 and PMS2 was 3.7%， 6.2%， 10.5% and 17.9% respectively. Among them， 4 cases （2.5%） and 15 cases （9.3%） had the common co-deletion expression types of MSH2/MSH6 and MLH1/PMS2 respectively. There were statistical differences in the expression of MSI in the degree of differentiation， depth of infiltration （P<0.05）. There were statistical differences in the clinicopathological characteristics of EA patients′ p53， such as age， differentiation degree， infiltration depth and lymph node metastasis （P<0.05）. Spearman correlation analysis showed that there was a obvious positive correlation between MSI and p53 （r=0.189，P<0.05）. Conclusion There is MMRP deficiency in patients with EA， and the expression deficiency in MLH1 and PMS2 is higher than that of MSH2 and MSH6. MSI and p53 are closely related to the clinicopathological characteristics of EA， and have reference value for the prediction of EA and the evaluation of malignancy degree. MSI and p53 protein are positively correlated， which may be involved in the occurrence and development of EA.

[Key words] Endometrial adenocarcinoma； MSH2； MSH6； MLH1； PMS2； p53； Immunohistochemistry

子宫内膜癌（endometrial carcinoma）是世界范围内女性常见的恶性肿瘤之一，发病率占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%[1-2]。子宫内膜癌中最常见的组织类型是子宫内膜样腺癌（endometrial adenocarcinoma，EA），占其中的80%～85%。子宮内膜癌每年的新发病例大约是15万例，位列女性癌症的第五位[3]。近年来，我国子宫内膜癌的发病率有逐年上升的趋势，且发病年龄渐趋年轻化，严重危害女性健康[4]。在大多数情况下，早期子宫内膜癌仅通过手术就可以治愈，发生侵袭和转移后其预后很差。

EA常见的分子遗传学的改变有抑癌基因PTEN的突变、肿瘤抑制基因p53的突变、KRAS原癌基因的突变及微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）。MSI涉及DNA错配修复（mismatch repair，MMR）基因的突变，导致无法修复重复序列（微卫星）中DNA复制过程中发生的错误。这种修复机制的丧失反过来导致包含微卫星的基因中的移码突变的累积[5]。MMR提供了几种遗传稳定功能：它纠正了DNA生物合成错误，确保基因重组的保真度，并参与细胞周期检查点/控制和细胞凋亡反应的最早步骤。MMR基因缺陷增加细胞恶性转化的风险，最终导致一个或几个与上皮完整性相关的基因的破坏[6]。p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，野生型p53是一种抑癌基因兼凋亡诱导基因，它编码一种DNA结合磷酸化蛋白，参与细胞周期的调控和调亡[7]。本研究采用免疫组化PV法检测EA中错配修复蛋白（mismatch repair protein，MMRP）和p53的表达情况，探讨其与EA的临床病理特征的关系，为EA的侵袭转移及预后判断提供客观指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究中的所有标本取自2017年1月～2018年12月在中南大学湘雅医院确诊并进行手术治疗的162例EA患者。年龄 29～75岁，平均（52±8）岁；有淋巴结转移者9例，无淋巴结转移者153例；分化程度：高分化子宫内膜样腺癌60例，中分化子宫内膜样腺癌53例，低分化子宫内膜样腺癌49例；浸润深度：黏膜内83例，浅肌层60例，深肌层19例；有脉管侵犯者5例，无脉管侵犯者157例；有神经侵犯者1例，无神经侵犯者161例。纳入标准：按照2010版WHO标准经病理检查确诊为EA；术前未进行放化疗；行子宫全切加双附件切除术。排除标准：活检标本；免疫组化的资料不完整者。该研究已经医院医学伦理学委员会批准，患者知情同意。所有标本均经病理检查确诊。

1.2 方法

送检组织经4%中性甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋，3 μm厚度切片，HE染色，光镜观察。选取肿瘤与正常组织同时存在的蜡块，4 μm厚度切片行免疫组化，采用Envision法，一抗为MSH2、MSH6、MLH1、PMS2及p53，抗体及所用免疫组化试剂均购于福州迈新生物技术开发有限公司，操作步骤按照试剂说明书进行。以上操作均用已知阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照，每例都有HE切片作对照观察。

1.3 结果判定

阳性结果明确，阳性信号的位置正确且染色特征正确。MSH2、MSH6、MLH1、PMS2及p53均定位于细胞核。对照组织即肿瘤周围的正常上皮细胞、肿瘤内浸润的淋巴细胞、间质细胞MMRP均出现细胞核着色，可作为内对照[8]。根据文献，阳性结果判定标准为MMRP和p53在细胞核明确着色表达判定为阳性，与核染色强弱以及阳性细胞弥漫或局灶分布无关；细胞核不着色判断为阴性。将4种MMRP中的1种以上表达缺失定为微卫星不稳定组（MSI组），全部阳性表达设为微卫星稳定组（MSS组）[3]。

1.4统计学方法

采用统计学软件SPSS 24.0分析数据，计数资料采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 MMRP在EA中的表达情况

4种MMRP表达均定位于肿瘤细胞核。162例EA患者中，MMRP阳性者（MMS组）120 例（74%），表达缺失者（MSI组） 42例，缺失率为26%，其中，MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达缺失率分别为3.7%、6.2%、10.5%、17.9%；MSH2 与 MSH6 共同缺失表达率为2.5%，MLH1 与 PMS2 共同缺失表达率为9.3%（表1）。

2.2 MMRP在EA不同临床病理特征中的差异表达

MSI组与MSS组相比，在分化程度、浸润深度方面比较，差异有统计学意义（P<0.05），表现为在MSI组肿瘤分化程度更低、浸润更深。而在年龄、淋巴结转移、脉管侵犯和神经侵犯等方面比较，差异均无统计学意义（P>0.05）（表2）。

2.3 p53在EA不同临床病理特征中的差异表达

p53的表达定位于肿瘤细胞核。在EA中的阳性表达率为53%，在年龄、分化程度、浸润深度、淋巴结转移方面比较，差异有统计学意义（P<0.05），在脉管侵犯和神经侵犯方面比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。

2.4 MMRP与p53在EA中表达的相关性

MSI与p53表达在在EA中成正相关（r=0.189，P<0.05）（表4） 。

3 讨论

根据临床病理学和分子遗传学特征的不同，子宫内膜癌可大致分为两大类，即Ⅰ类（雌激素依赖性肿瘤）和Ⅱ类（非激素依赖性肿瘤）。最常见的子宫内膜癌，即EA，临床上有多种危险因素，如肥胖、糖尿病、未经产、高血压及绝经晚[9-11]。在过去30年，在子宫内膜癌的发生、发展过程中发现许多原癌基因和抑癌基因突变、MSI等分子遗传学的改变起着非常重要的作用并影响预后。尽管有最先进的一线手术，激素治疗和化疗，但肿瘤进展到晚期和肿瘤复发仍旧会导致预后不良和高死亡率，这也是影响子宫内膜癌治疗的主要问题[12]。

有许多修复机制用于识别和去除各种特定类型的DNA损伤。完整DNA的恢复机制取决于细胞周期的阶段，病变的类型和环境因素。然而，所有修复机制都使用细胞完整的互补DNA链作为模板来恢复原始链[13]。根据用于修复的分子和修复的时间段，细胞修复机制分为直接和间接修复机制。在复制过程中，当子DNA仍在合成时，直接修复机制由DNA聚合酶或O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）介导[14]。间接修复则涉及在合成新DNA期间发生的损伤并且在合成过程之后发生。它本质上是一个后复制过程，通常弥补直接修复的不可修复性。在此合成过程中DNA复制的许多蛋白质也参与与辅助。间接修复机制进一步分为三类：切除修复，重组修复和MMR。

DNA MMR是在DNA稳态中起关键作用的重要酶系统之一，其涉及修复分裂体细胞中DNA复制过程中发生的特定类型的错误[15]。该系统的遗传损失导致修复机制减少，因此导致潜在突变的加速积累（称为MSI）[16]。到目前为止，已发现MMR基因多达九种，其中最常见发生突变的四个MMR基因分别为MSH2、MSH6、MLH1、PMS2；其中任何一个的表达缺失都将导致MMR系统功能异常，进而促进肿瘤的发生和进展[17]。

p53基因是目前研究得最为广泛及深入的肿瘤基因之一，它的突变与多种肿瘤的发生、发展密切相关[7]。p53基因基因发生突变后其编码的蛋白失去了其相应的功能，表现为癌基因的形态，进一步诱导肿瘤的发生、发展[18]。EA中约10%可以检测到p53基因突变，多见于3级EA[19]。

本研究结果显示，MSH2缺失者占3.7%，MSH6表达缺失占6.2%，MLH1缺失者占10.5%，PMS2缺失者占17.9%，提示这4种蛋白的突变情况与EA的发生、发展有着密切的相关性。EA中MMRP表达缺失以MLH1和PMS2为主，这一结果与国外的研究[20]基本一致。本研究结果中，MMRP表达情况在在分化程度、浸润深度方面比较，差异有统计学意义（P<0.05）；p53的阳性表达率为53%，且其表达在年龄、分化程度、浸润深度、淋巴结转移方面比较，差异有统计学意义（P<0.05）；MSI与p53成正相关（r=0.189，P<0.05）。

综上所述，MMRP（MSH2、MSH6、MLH1、PMS2）和p53在EA的临床病理诊断中有重要参考价值，MMRP及p53与EA的临床病理特征关系密切，对该疾病的预测以及恶性程度的评估具有重要的参考价值，且两者成正相关，可能参与了EA的发生、发展过程。

[参考文献]

[1]Mao S，Ma J，Yu H.Sirtuin-7 knockdown inhibits the growth of endometrial cancer cells by inducing apoptosis via the NF-κB signaling pathway[J].Oncol Lett，2019，17（1）：937-943.

[2]Wang J，Jia N，Lyv T，et al.Paired box 2 promotes progression of endometrial cancer via regulating cell cycle pathway[J].J Cancer，2018，9（20）：3743-3754.

[3]Mark E，Sherman MD.Theories of endometrial carcinogenesis：a multidisciplinary approach[J].Mod Pathol，2000，13（3）：295-308.

[4]周正平，肖庆邦，罗祖强.子宫内膜样腺癌组织中p57～（KIP2）、cyclin E蛋白表达与临床病理特征的关系[J].肿瘤防治研究，2013，40（9）：860-863.

[5]Sameer AS，Nissar S，Fatima K.Mismatch repair pathway：molecules，functions，and role in colorectal carcinogenesis[J].Eur J Cancer Prev，2014，23（4）：246-257.

[6]Roberts ME，Jackson SA，Susswein LR，et al.MSH6 and PMS2 germ-line pathogenic variants implicated in Lynch syndrome are associated with breast cancer[J].Genet Med，2018， 20（10）：1167-1174.

[7]Attias-Geva Z，Bentov I，Kidron D，et al.p53 Regulates insulin-like growth factor-I receptor gene expression in uterine serous carcinoma and predicts responsiveness to an insulin-like growth factor-I receptor-directed targeted therapy[J].Eur J Cancer，2012，48（10）：1570-1580.

[8]晋薇，马亚琪，王昀，等.错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2在子宮内膜癌中的表达及临床意义[J].诊断病理学杂志. 2018，25（5）：335-339.

[9]Levi F，Franceschi S，Negri E，et al.Dietary factors and the risk of endometrial cancer[J].Cancer，1993，71（11）：3575-3581.

[10]Voskuil DW，Monninkhof EM，Elias SG，et al.Physical activity and endometrial cancer risk，a systematic review of current evidence[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007，16（4）：639-648.

[11]Cao X，He GZ.Knockdown of CLDN6 inhibits cell proliferation and migration via PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in endometrial carcinoma cell line HEC-1-B[J].Onco Targets Ther，2018，11：6351-6360.

[12]Chaudhry P，Asselin E.Resistance to chemotherapy and hormone therapy in endometrial cancer[J].Endocr Relat Cancer，2009，16（2）：363-380.

[13]Michailidi C，Papavassiliou AG，Troungos C.DNA repair mechanisms in colorectal carcinogenesis[J].Curr Mol Med，2012，12（3）：237-246.

[14]Hoeijmakers JH.Genome maintenance mechanisms for preventing cancer[J].Nature，2001，411（6835）：366-374.

[15]Jascur T，Boland CR.Structure and function of the components of the human DNA mismatch repair system[J].Int J Cancer，2006，119（9）：2030-2035.

[16]Iyama T，Wilson DM.DNA repair mechanisms in dividing and non-dividing cells[J].DNA Repair （Amst），2013，12（8）：620-636.

[17]晋龙，眭玉霞，王丽萍，等.结直肠癌错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6及PMS2表达与临床病理特征的关系[J].诊断病理学杂志，2017，24（11）：813-817.

[18]孙立伟，姜镕，李金铎，等.P53、EGFR、VEGF在胶质母细胞瘤的研究进展[J].继续医学教育，2017，31（11）：86-89.

[19]Lax SF，Kendall B，Tashiro H，et al.The frequency of p53，K-ras mutations，and microsatellite instability differs in uterine endometrioid and serous carcinoma：evidence of distinct molecular genetic pathways[J].Cancer，2000，88（4）：814-824.

[20]Ruiz I，Martín-Arruti M，Lopez-Lopez E，et al.Lack of association between deficient mismatch repair expression and outcome in endometrial carcinomas of the endometrioid type[J].Gynecol Oncol，2014，134（1）：20-23.

（收稿日期：2019-01-24 本文編辑：许俊琴）