孙玉姣， 崔湘怡， 高润凝

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

可得然胶(curdlan)，又称凝结多糖，是一种天然的直链型微生物发酵多糖.可得然胶是由D-葡萄糖以β-(1→3)糖苷键连接而成的葡聚糖.这种大分子由300～500个葡萄糖残基组成，其平均聚合度(degree of polymerization,DP)约为450，相对分子量(Mr)约为74 000 Da，分子式为(C6H10O5)n.可得然胶作为乳化剂、稳定剂、持水剂和增稠剂等广泛应用于食品领域[1].

近年来，多糖的化学分子修饰，尤其是硫酸化修饰受到了食品化学、医药科学等领域工作者的广泛关注.硫酸化修饰是通过化学方法在多糖分子结构中引入硫酸基团，从而使多糖糖链中单糖分子的羟基被硫酸基团取代.相比于天然多糖，硫酸化修饰多糖具有更加广泛和优越的生物活性.许多研究证实，硫酸化多糖比未进行硫酸化修饰的多糖具有更强的生物特性，具有明显的抗菌、抗病毒、抗凝血、抗氧化及抗肿瘤等生物学活性[2-7].此外，多糖经过硫酸化修饰后，生物活性增强，可以有效提高多糖的利用率，对其开发与应用具有深远意义.

细胞在正常的代谢和生长过程中会产生一系列活性氧(ROS)，例如超氧阴离子(·O2-)，羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)等.它们能够破坏脂质、蛋白质和核酸等生物大分子，导致癌症、糖尿病、神经退行性疾病和组织炎症等许多疾病的发生[8,9].一些食物的变质也与食品中的脂质或者不饱和脂肪酸的氧化有关.由ROS引起的脂质氧化会引起脂类食品营养价值的降低，不仅造成食物外观受损，还会增加食品安全的风险.抗氧化性是天然多糖本身就具备的一大生物活性，主要依赖于多糖分子上存在的大量羟基.而经过硫酸化修饰，多糖的抗氧化性会发生不同程度的增强，对进一步开发和利用多糖资源提供了有效的手段[10,11].大量研究发现，硫酸基团在抗氧化活性中起着重要作用.Wang等[12]通过对沙蒿多糖进行硫酸化修饰，获得了取代度范围为0.51～1.28的硫酸化沙蒿多糖，体外抗氧化研究发现，硫酸化沙蒿多糖的抗氧化活性包括对DPPH、·O2-、和·OH自由基的清除能力以及还原能力都随着硫酸化取代程度的增加而增加.Jin等[13]基于细胞水平的氧化损伤模型研究发现，硫酸化多糖可显著提高H2O2损伤的小鼠巨噬细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)含量，表现出对氧化损伤细胞较强的保护能力.然而，目前对可得然胶的硫酸化修饰及其抗氧化评估的研究却鲜有报道.

因此，本研究采用非选择性硫酸化修饰、伯羟基硫酸化修饰和非伯羟基硫酸化修饰方法，分别对可得然胶进行硫酸化修饰，进而研究硫酸化可得然胶对DPPH、羟自由基(·OH)、超氧阴离子(·O2-)自由基的清除能力以及硫酸化可得然胶的还原力，从而评估硫酸化可得然胶的抗氧化活性.本研究将为可得然胶的进一步开发利用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 主要材料

可得然胶，食品级，购于日本武田-麒麟食品公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，购于美国sigma公司；其余试剂均为国产分析纯.

1.2 实验方法

1.2.1 硫酸化可得然胶的制备

(1)非选择性硫酸化修饰

分别称取0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g三乙胺-三氧化硫，加入25 mL二甲基甲酰胺和0.5 g可然得胶粉末，于50 ℃搅拌反应12 h.反应完成后，用5 mol/L NaOH中和反应物，加入三倍体积95%乙醇，静置过夜后离心，收集沉淀物，干燥，然后溶于少量蒸馏水，用截留分子量为300 Da的透析袋透析.

(2)伯羟基硫酸化修饰

①三苯甲基保护

将0.5 g可然得胶溶解于20 mL吡啶，一小时内分三次加入0.5 g三苯基氯乙烷，反应4 h.共做五份.

②乙酰化反应

将每份反应物中加入20 mL乙酸酐，在95 ℃下反应3 h，反应后将混合物倒入冰水中，其间不断搅拌，然后加水离心两次.

③脱去三苯甲基保护层

将反应物溶于20 mL二氯甲烷，充分溶解后蒸干，重复进行一次.将蒸干后的反应物溶于100 mL二氯甲烷中，加入10 mL乙酸、4 mL浓盐酸，在0 ℃搅拌反应3 h.反应完成后，用饱和碳酸氢钠将其中和，分液，得到二氯甲烷相.

④硫酸化修饰

将反应物蒸干，再加入20 mL二氯甲烷重复蒸干一次.分别称取0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g三乙胺-三氧化硫加入反应物中，再各加入25 mL二甲基甲酰胺，在搅拌器中于50 ℃搅拌反应12 h.反应完成后，用5 mol/L NaOH中和反应物，加入三倍体积95%乙醇，静置过夜后离心，收集沉淀物，干燥.

⑤脱乙酰基

将产物溶于20 mL甲醇蒸干，再加入20 mL甲醇重复蒸干一次.将蒸干后的产物溶于100 mL甲醇中，在氮气保护下加入0.1 g甲醇钠.在氮气保护下于50 ℃搅拌反应2 h.反应结束后，将产物蒸干，溶于少量蒸馏水，用截留分子量为300 Da的透析袋透析.

(3)非伯羟基硫酸化修饰

①三苯甲基保护

将0.5 g可然得胶溶解于20 mL吡啶，一小时内分三次加入0.5 g三苯基氯乙烷，反应4 h.共做五份.

②硫酸化修饰

将每份反应物蒸干，再加入20 mL甲醇重复蒸干一次.分别称取0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g三乙胺-三氧化硫加入反应物中，再各加入25 mL二甲基甲酰胺，在搅拌器中于50 ℃搅拌反应12 h.反应完成后，用5 mol/L NaOH中和反应物，加入三倍体积95%乙醇，静置过夜后离心，收集沉淀物，干燥.

③脱去三苯甲基保护层

将反应物溶于20 mL二氯甲烷蒸干，再加入20 mL二氯甲烷重复蒸干一次.将反应物溶于100 mL二氯甲烷中，加入10 mL乙酸、4 mL浓盐酸，在0 ℃搅拌反应3 h.反应完成后，将产物蒸干，溶于少量蒸馏水，用截留分子量为300 Da的透析袋透析，然后用5 mol/L NaOH调pH.

1.2.2 硫酸基含量的测定

硫酸基含量的测定采用BaCl2-明胶法[14].以K2SO4为标准，绘制标准曲线.分别加入1 mL三氯乙酸，1 mL比浊液(0.5 g明胶和0.5 g BaCl2溶解在100 mL去离子水中，静置过夜，离心除去不溶物，即为BaCl2-明胶比浊液).摇匀，室温静置 20 min，在360 nm处测定吸光度，记为A1.然后，以1 mL的明胶溶液代替该比浊液，测得的吸光值记为A2.绘制标准曲线，横坐标为硫酸基团毫克数，纵坐标为 A=A1-A2，得到线性回归方程.

样品的硫酸基含量测定：分别取5 mg的硫酸化产物溶解于1 mL的1 mol/mL HCl 溶液中，在100 ℃下消化6 h.冷却离心后，吸取各样品溶液 0.1 mL，按以上操作方法测定其吸光度值.根据回归方程计算出各个样品中的硫酸基含量.

1.2.3 硫酸化可得然胶抗氧化的评估

将可得然胶及其硫酸化产物配制成5 mg/mL的溶液，并稀释为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL的样品待测液.

(1)DPPH自由基能力测定

将DPPH溶于甲醇中，配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液.取1 mL不同浓度的样品待测液，加入2 mL配制好的DPPH溶液与2 mL甲醇，震荡均匀，室温下避光反应15 min，在517 nm下测定吸光值，计算对DPPH清除率[15,16].

(2)羟自由基(·OH)清除能力的测定

采用水杨酸比色法，取1 mL上述浓度的待测样品溶液于10 mL的试管中，依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2启动反应，震荡混匀，于37 ℃水浴反应37 min，冷却，在510 nm下测定吸光值，计算对·OH清除率[15,16].

(3)超氧阴离子自由基(·O2-)清除能力的测定

取上述浓度的待测液1 mL，依次加入1 mL pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液(50 mmol/L)，0.2 mL 7 mmol/L的邻苯三酚溶液，震荡混匀，反应10 min后，加入1 mL浓盐酸终止反应，在320 nm下测定吸光值，计算对·O2-清除率[15,16].

(4)还原力测定

取不同浓度的样品溶液1 mL，加入1 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.6)和0.125 ml 1%(w/v)的铁氰化钾溶液，混合物于50 ℃下水浴20 min.然后加入0.125 mL 10%(w/v)的三氯乙酸，加入1.5 mL的氯化铁显色.震荡混匀，在700 nm处测定吸光值[15,16].

2 结果与讨论

2.1 可得然胶的硫酸基团含量分析

基于非选择性硫酸化修饰、伯羟基硫酸化修饰和非伯羟基硫酸化修饰等策略，可得到不同硫酸化修饰的可得然胶产物.对于非选择性硫酸化修饰，硫酸化取代反应会发生在β-D-葡萄糖单元的2、4或6位羟基上；对于伯羟基硫酸化修饰，硫酸化取代反应仅发生在β-D-葡萄糖单元的6位羟基上；对于非伯羟基硫酸化修饰，硫酸化取代反应主要发生在β-D-葡萄糖单元的2或4位羟基上，如图1所示.

图1 可得然胶的硫酸化取代反应

以K2SO4为标准，绘制出标准曲线，通过计算得出不同可得然胶硫酸化修饰产物的硫酸基团含量，如表1所示.结果发现，可得然胶均得到了良好的硫酸化修饰，并且硫酸基团的含量随着硫酸化试剂浓度的提高而增加.

表1 硫酸化修饰的可得然胶硫酸基含量分析

*a、b、c和d为显著性差异分析(p<0.05).

2.2 硫酸化可得然胶对DPPH自由基的清除能力

通过比较非选择性硫酸化修饰可得然胶产物(如图2所示)、伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物(如图3所示)和非伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物(如图4所示)对DPPH自由基的清除能力，结果发现，伯羟基硫酸化修饰和非伯羟基硫酸化修饰更有助于提高可得然胶对DPPH自由基的清除作用.并且，在伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物中，样品4的硫酸基团含量为14.31±1.21%表现出最强的清除能力；在非伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物中，样品4的硫酸基团含量为20.84±0.38%同样表现出最强的清除能力.

图2 非选择性硫酸化修饰可得然胶对DPPH自由基的清除能力

图3 伯羟基硫酸化修饰可得然胶对DPPH自由基的清除能力

图4 非伯羟基硫酸化修饰可得然胶对DPPH自由基的清除能力

2.3 硫酸化可得然胶对羟自由基(·OH)的清除能力

通过比较非选择性硫酸化修饰可得然胶产物(如图5所示)、伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物(如图6所示)和非伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物(如图7所示)对羟自由基(·OH)的清除能力，结果发现，非硫酸化修饰和非伯羟基硫酸化修饰更有助于提高可得然胶对·OH自由基的清除作用.并且，在不同硫酸化修饰产物中，各组的样品4均对·OH自由基表现出了较强的清除能力.

图5 非选择性硫酸化修饰可得然胶对羟自由基的清除能力

图6 伯羟基硫酸化修饰可得然胶对羟自由基的清除能力

图7 非伯羟基硫酸化修饰可得然胶对羟自由基的清除能力

2.4 硫酸化可得然胶对超氧阴离子自由基(·O2-)的清除能力

通过比较非选择性硫酸化修饰可得然胶产物(如图8所示)、伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物(如图9所示)和非伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物(如图10所示)对超氧阴离子(·O2-)的清除能力，结果发现，硫酸化可得然胶对·O2-自由基的清除能力随着硫酸基团含量的增加而提高.并且，伯羟基硫酸化修饰和非伯羟基硫酸化修饰更有助于提高可得然胶对·O2-自由基的清除作用.在非选择性硫酸化修饰产物中，样品5的硫酸基团含量为12.78±0.41%表现出最强的清除能力；在伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物中，样品3和4的硫酸基团含量分别为12.83±0.91%和14.31±1.21%，表现出较强的清除能力；在非伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物中，样品4同样表现出最强的清除能力.

图8 非选择性硫酸化修饰可得然胶对超氧阴离子自由基的清除能力

图9 伯羟基硫酸化修饰可得然胶对超氧阴离子自由基的清除能力

图10 非伯羟基硫酸化修饰可得然胶对超氧阴离子自由基的清除能力

2.5 硫酸化可得然胶的还原能力

通过比较非选择性硫酸化修饰可得然胶产物(如图11所示)、伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物(如图12所示)和非伯羟基硫酸化修饰可得然胶产物(如图13所示)的还原能力，结果发现，硫酸化修饰并没有有效提高可得然胶的还原能力.对于非伯羟基硫酸化修饰产物，样品3和4相较于其他硫酸化样品有轻微增强.

图11 非选择性硫酸化修饰可得然胶的还原能力

图12 伯羟基硫酸化修饰可得然胶的还原能力

图13 非伯羟基硫酸化修饰可得然胶的还原能力

3 结论

本文探讨了不同硫酸化可得然胶产物的抗氧化能力，包括DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和还原能力.结果表明，硫酸化修饰可有效提高可得然胶对自由基的清除能力，表现出较强的抗氧化活性.本研究结果将为可得然胶的进一步开发利用提供理论依据.