曹云刚， 陈星怡， 齐梦恬， 李 颖， 赵倩倩

(陕西科技大学 食品与生物工程学院, 陕西 西安 710021)

0 引言

茶多酚(Tea Polyphenols)是茶叶中多酚类物质的总称，是目前应用最广泛的天然抗氧化剂之一，其主要活性成分是儿茶素类化合物(Catechin)，约占茶多酚含量的75%～80%.儿茶素类化合物主要分为四种：表儿茶酚(epicatechin EC)、表没食子儿茶酚(epigallocatechin EGC)、表儿茶酚没食子酸(epicatechin gallate ECG)和表没食子儿茶酚没食子酸(epigallocatechin gallate EGCG)[1-3].

其中EGCG是 2-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯，结构中含有6个邻位酚羟基(如图1所示)，是儿茶素中含量最高、抗氧化能力最强的组分.同时现有研究表明EGCG还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗突变、降压、降脂、降血糖、防止消化道和呼吸道感染、预防和治疗癌症、抑制和预防心血管疾病等生理活性功能[4,5].因此，EGCG和其他儿茶素类化合物经常被用做功能性食品(如乳品和饮料等)的添加剂.

然而，研究发现儿茶素类物质在中性和碱性条件下非常不稳定，随着pH、温度和氧气浓度的升高，降解速度逐渐加快[6].EGCG 的氧化物和聚合物会产生一种不期望的黄绿色，诸如此类的不稳定性限制了EGCG在食品工业中的应用[7].如何提高EGCG在加热等过程中的稳定性是当前面临的挑战.

图1 EGCG结构示意图

酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白质，约占牛乳中总蛋白的80%左右，具有较高的营养价值和良好的加工性能.牛乳酪蛋白包含四种主要蛋白质：αs1-酪蛋白,αs2-酪蛋白,β-酪蛋白和κ-酪蛋白，这四种蛋白的摩尔比约为4∶1∶4∶1.3，在酪蛋白中的含量分别为：αs1-酪蛋白≥22%、αs2-酪蛋白≥5.5%、β-酪蛋白≥22%、κ-酪蛋白≥7.15%[7-9].这四种酪蛋白分子量接近(均约为24 kDa)，并含有很大比例的脯氨酸残基.其中β-酪蛋白由209个氨基酸组成且不含二硫键，其相对灵活(松散、自然展开)的结构使得其对热更加稳定，且易于与其他物质结合[9].现有研究已经表明，β-酪蛋白可以与疏水性和双亲化合物如维生素D、槲皮素、白藜芦醇、黄酮、姜黄素和丹宁酸等相互作用，从而作为它们的天然纳米运载工具[7].蛋白质与多酚类物质相互作用受蛋白质和多酚结构、温度、pH等因素的影响，二者结合又会影响各自的功能特性及生物利用率.

因此，本研究采用荧光猝灭法探究不同温度下β-酪蛋白与EGCG的相互作用机制，以期为合理控制食品加工条件改善EGCG的稳定性、科学设计天然活性组分的蛋白纳米载体等提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

(1)主要材料与试剂：β-酪蛋白(≥98%)，Sigma-Aldrich公司；EGCG(>98%)，上海纯优生物科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸，天津市天力化学试剂有限公司；纯净水，娃哈哈集团.

(2)主要仪器设备：PHS-25型数显pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司；微量移液器，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司； FS5荧光光谱仪,英国爱丁堡仪器公司；MIX-25P型迷你混合仪，杭州米欧仪器有限公司；TP-350S型智能磁力加热搅拌器，杭州米欧仪器有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液的配置

β-酪蛋白存储液(10.0μmol/L)：用20 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.5)配制浓度为10.0μmol/Lβ-酪蛋白溶液，置于4 ℃冰箱中储存备用.

EGCG工作液(100.0μmol/L)：用20 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.5)配制浓度为100.0μmol/L EGCG溶液.用PBS溶液稀释出一系列浓度梯度的EGCG溶液：0、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L和100μmol/L.所有EGCG溶液现配现用.

1.2.2 荧光猝灭分析

将不同浓度EGCG 溶液(0、1、2、4、10、20、40、60、80和100μmol/L)与β-酪蛋白溶液(10.0μmol/L)按照1∶1比例混合均匀(各2.5 mL)，在不同温度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)水浴中加热30 min后，迅速冷却至室温.最终混合液中，β-酪蛋白终浓度为：5.0μmol/L，EGCG终浓度梯度为：0、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L.同时将不同浓度EGCG 溶液(0、1、2、4、10、20、40、60、80和100μmol/L)与20 mmol/L磷酸盐缓冲液按照1∶1比例混合均匀(各2.5 mL)作为空白对照.参考范志飞等人描述的方法[10]，在室温下利用荧光光谱仪记录混合液体和相应空白对照的荧光强度，设定激发波长为 280 nm，扫描波长为 300～500 nm，激发狭缝宽度为3.3 nm，发射狭缝宽度为2.0 nm.

2 结果与讨论

2.1 不同加热处理对β-酪蛋白内源荧光的影响

β-酪蛋白含有一个位于蛋白表面的色氨酸残基(Trp143)，Trp143受激发后发射的荧光是β-酪蛋白内源荧光的主要来源[11].蛋白质最大内源荧光强度(Fmax)和对应的最大荧光发射波长(λmax)的变化可以间接反映蛋白构象的变化[12].

如表1所示，无EGCG存在时，不同温度处理对β-酪蛋白的Fmax和λmax具有不同的影响：与对照(25 ℃)相比，35 ℃处理几乎无影响；45 ℃处理30 min导致β-酪蛋白的Fmax升高约3.0%，同时λmax红移动约2 nm；这说明45 ℃处理30 min对β-酪蛋白中的Trp143残基的微环境产生了较为明显的影响，或者说该条件下处理使得β-酪蛋白中的Trp143残基的微环境变得更加亲水性或极性[7].加热温度对β-酪蛋白内源荧光的影响与其自身的结构变化以及β-酪蛋白自我缔合与解离行为有关：在低温(0～8 ℃)下，β-酪蛋白以单体的形式存在于溶液中；当温度高于20 ℃时，β-酪蛋白单体发生聚合和自我缔合；当温度高于90 ℃时，β-酪蛋白聚集体发生热解离[13].

表1 不同温度处理后β-酪蛋白的最大内源荧光强度(Fmax)和对应最大荧光发射波长(λmax)

2.2 β-酪蛋白-EGCG复合物的荧光猝灭

不同温度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)下，β-酪蛋白与EGCG相互作用的荧光淬灭光谱如图2所示.从图2可以看出，随着 EGCG 浓度的增加，β-酪蛋白的荧光发射峰强度逐渐降低，当EGCG终浓度为 50μmol/L时，β-酪蛋白的荧光发射峰强度最低，由此可以推断EGCG 与β-酪蛋白生成了复合物，同时也改变了β-酪蛋白的空间结构[14]：与EGCG的结合导致β-酪蛋白的分子构象进一步展开，使得色氨酸残基(Trp143)暴露于更加亲水的环境中.不同温度下，EGCG对β-酪蛋白的荧光猝灭程度不同，比如，当EGCG终浓度为 50μmol/L时，荧光猝灭率分别为77.8%(25 ℃)、76.5%(35 ℃)和84.6%(45 ℃)，说明温度升高增强了EGCG与β-酪蛋白之间的相互作用.与本实验结果类似，He等[7]研究发现随着温度的升高EGCG对β-酪蛋白的荧光猝灭作用增强.

(a)25 ℃下EGCG对β-酪蛋白的荧光猝灭光谱

(b)35 ℃下EGCG对β-酪蛋白的荧光猝灭光谱

(c)45 ℃下EGCG对β-酪蛋白的荧光猝灭光谱图2 EGCG对β-酪蛋白的荧光猝灭光谱

荧光猝灭反应的类型主要有：动态猝灭与静态猝灭[15].无论EGCG对β-酪蛋白的荧光猝灭是一个动态猝灭或者静态猝灭过程，均可根据Stern-Volmer 方程(1)计算其双分子荧光猝灭速率常数(Kq)，据此可判定其猝灭类型.

F0/F=1+Kqτ0c(EGCG)=1+

KSVc(EGCG)

(1)

式(1)中：F0和F分别为EGCG加入前后β-酪蛋白荧光发射峰的强度；Kq为双分子猝灭速率常数(L/(mol·s))；τ0为不存在荧光猝灭剂时的荧光寿命(对于生物大分子来说τ0=10-8s-1)[16]；c(EGCG)是荧光猝灭剂EGCG的浓度(mol/L).KSV是Sterne-Volmer 动态猝灭常数(L/mol)，可以通过F0/F对c(EGCG)做线性回归，其线性部分的斜率即为KSV.

根据方程式(1)，对于单一的动态猝灭或静态猝灭过程,以β-酪蛋白与EGCG作用前后荧光发射峰的强度变化F0/F对荧光猝灭剂浓度c(EGCG)为轴制作散点图并算出趋势线方程，方程的斜率代表Sterne-Volmer 动态猝灭常数KSV.

图3为不同温度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)下β-酪蛋白与不同浓度EGCG相互作用的荧光发射峰的强度F0/F-c(EGCG) 曲线.从图3可以看出，F0/F-c(EGCG)呈线性关系，随着温度升高荧光猝灭曲线的斜率增加，并且可以计算出25 ℃、35 ℃ 和45 ℃ 下双分子猝灭速率常数Kq分别为0.664×1013L/(mol·s)、0.629×1013L/(mol·s)和0.945×1013L/(mol·s).

一般情况下，生物大分子的双分子荧光动态猝灭速率常数Kq小于2×1010L/(mol·s)，由此可以判断 EGCG对β-酪蛋白的荧光猝灭是由于 EGCG 与β-酪蛋白形成了复合物而引起的静态猝灭，是通过荧光基团(Trp143)与荧光猝灭剂(EGCG)之间形成了一个复杂的循环[17,18].不同温度下EGCG对β-酪蛋白的双分子猝灭速率常数Kq的变化与温度诱导的β-酪蛋白构象变化等有关.

图3 不同温度下EGCG对β-酪蛋白荧光猝灭的Stern-Volmer曲线

2.3 EGCG与β-酪蛋白的表观结合常数及结合位点数

由于EGCG对β-酪蛋白的荧光猝灭主要是静态猝灭，其结合常数(KA)和结合位点数(n)可通过公式(2)计算得出：

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgc(EGCG)

(2)

式(2)中：F0和F分别为EGCG加入前后β-酪蛋白荧光发射峰的强度；KA为结合常数；n为结合位点数；c(EGCG)为EGCG浓度(mol/L).

以lg[(F0-F)/F]对lgc(EGCG)作图，本实验范围内呈线性关系，因而拟合直线的斜率为结合位点数(n)，截距为结合常数(KA)，计算结果见表2.

由计算结果可知，EGCG与β-酪蛋白的结合常数达104数量级，并形成一个结合位点.在25 ℃温度条件下二者之间就能较好的结合，温度升高有利于二者之间的结合.朱美霖等[14]在研究EGCG与人血清白蛋白(HSA)相互作用时也得到了类似的实验结果.

表2 不同温度下EGCG 与β-酪蛋白的结合常数(KA)和结合位点数(n)

2.4 EGCG 与 β-酪蛋白的主要作用力类型

生物大分子与小分子的作用力类型一般包括：氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力这四种[19].根据不同温度下的热力学参数：焓变ΔH、自由能变化ΔG和熵变ΔS等，可以判断EGCG与β-酪蛋白的主要作用力类型.

在温度变化范围不大时，ΔH 可看作是常数，由热力学参数方程(3，4)可以计算出EGCG和β-酪蛋白在不同温度下相互作用的热力学参数值,结果见表3所示.

ln(K2/K1)=(1/t1-1/t2)ΔH/R

(3)

ΔG=ΔH-tΔS=-RtlnK

(4)

式(3)、(4)中：K1，K2分别为不同温度下EGCG与β-酪蛋白的结合常数(KA)；t1，t2分别为不同温度，单位为K；R为气体常数，R=8.314J/(mol·K)；ΔH为焓变；ΔG为自由能变化；ΔS为熵变.

表3 不同温度下EGCG与β-酪蛋白结合过程的热力学参数

ΔG为吉布斯自由能，是在某一个热力学过程中，系统减少的内能中可以转化为对外做功的部分.当ΔG<0时反应自发；ΔG>0时反应逆方向自发；ΔG=0时反应平衡[20].从表3可以看出,EGCG与β-酪蛋白的复合物在形成过程中的ΔG<0，说明结合过程是一个自发过程.生物大分子与小分子作用力类型的热力学规律为：(1)ΔS>0的情况下作用力类型可能是疏水作用力与静电作用力；(2)ΔH>0同时ΔS>0的情况下作用力类型为疏水作用力；(3)ΔH<0的情况下作用力类型主要为静电相互作用[19].根据此规律并结合上述结果分析可知，该体系中EGCG与β-酪蛋白之间的作用力是以疏水作用力为主.由于ΔH

3 结论

采用荧光猝灭法研究了不同温度下β-酪蛋白与EGCG之间的相互作用，研究结果表明： EGCG与β-酪蛋白发生了静态荧光猝灭，形成了β-酪蛋白-EGCG复合物；当温度为25 ℃、35 ℃和45 ℃时，其双分子猝灭速率常数Kq分别为0.664×1013L/(mol·s)、0.629×1013L/(mol·s) 和0.945×1013L/(mol·s)，结合位点数分别为0.836 6、0.922 3与0.958 6.热力学参数分析结果显示EGCG 与β-酪蛋白形成复合物的过程中ΔG<0，说明该结合过程是一个自发过程，ΔH>0且ΔS>0说明EGCG与β-酪蛋白之间的作用力是以疏水相互作用为主.