贾 玮， 张 荣， 陈雪峰， 储晓刚, 2

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021; 2.中国检验检疫科学研究院， 北京 100123)

0 引言

近十年来，在世界乳制品贸易持续扩张的背景下，我国乳制品行业迅猛发展，而陕西为其主要产区[1-3].因奶牛在饲养过程中食用含有农药残留的饲料，使得乳制品中含有部分农药残留[4-7]，同时农药的种类和使用范围逐渐增加[8,9]，现有的方法难以同时分析乳制品基质中不同类型的农药残留[10,11].目前，常用于农药残留的前处理方法有凝胶渗透色谱法[12]、分散固相萃取法[13]、固相萃取法[14]、快速溶剂萃取[15]等，而分散固相萃取法因简便、快速、高效等特点，广泛地应用于农药残留的分析中[16-18].

实验使用分散固相萃取技术将巴氏杀菌乳进行提取净化后，利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱质谱建立同时测定巴氏杀菌乳中24种农药残留的筛查方法，旨在为监控乳制品中农药残留同时降低乳制品质量安全危机提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、甲苯(色谱纯)购自德国Merck公司；甲酸、甲酸铵、乙酸、乙酸铵购自美国Sigma公司；无水硫酸镁、无水乙酸钠购自美国Supelco公司；氯化钠(GR)购自荷兰Akzo Nobel公司；灭多虫、多菌灵、草特灵、毒草安、莠灭净、唑虫酰胺、甲氧噻草胺、溴丁酰草胺、三嗪茚草胺、甲草胺、猛杀威、灭草烟、伏草隆、氟啶草酮、嗪氨灵、乙虫腈、胺丙畏、燕麦灵、敌乐胺、戊草丹、禾草灵、氟胺氰菊酯、联苯菊酯和丁基嘧啶磷共24种农药标准品(纯度均大于95%)购自德国Sigma-Aldrich公司及德国Dr.Erenstofer公司.

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱质谱，配备有电喷雾离子源(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Accucore C-18 aQ色谱柱预柱与Hypersil Gold aQ C-18色谱柱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Avnti J-26×PI型高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；Milli-R04纯水仪(德国Millipore公司)；Vortex.Genie2T型旋涡混合器(美国Scientific Industries公司).

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

称取24种农药标准品各10 mg，选用甲醇、乙腈或甲苯配制成1 000 mg/L的单一化合物标准储备液，避光保存于-20 ℃.移取12份各5 mL巴氏杀菌乳空白样品(实验前测定)提取液配制基质匹配混合标准工作溶液，运用真空氮气吹干仪吹至近干后，配制1～500μg/L的基质匹配标准溶液.实验所用所有标准溶液均现用现配.

1.3.2 样品前处理

称取混匀巴氏杀菌乳5 g(精确至0.01 g)，加入10 mL 1%乙酸-乙腈/水(84∶16)溶液至50 mL离心管中，涡旋振荡30 s后加入1.45 g无水乙酸钠、6.0 g无水硫酸镁与陶瓷均质石，涡旋30 s后振荡提取1 min，离心5 min(4 ℃、10 000 r/min)，取滤液200μL至进样小瓶中，加入甲醇300μL及8 mmol/L甲酸铵水溶液500μL.涡旋30 s后经0.22μm滤膜过滤，进行测定.

1.3.3 色谱质谱条件

使用Accucore C-18 aQ预柱(10 mm×2.1 mm，1.9μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)与Hypersil Gold aQ C-18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)，柱温35 ℃，进样量5μL.流动相为水+0.1%甲酸+4 mmol/L甲酸铵(A)与甲醇+0.1%甲酸+4 mmol/L甲酸铵(B).梯度洗脱：0 min，100% A，1～7 min，100% A～0% A，12～13 min，0% A～100% A，13～15 min，100% A，流速为0.3 mL/min.电喷雾离子化(ESI)离子源，正离子模式，鞘气流速为18 L/min，鞘气压力为275 Kpa，辅助气流速为3 L/min；毛细管电压为3 500 V，毛细管温度为320 ℃.全扫描模式分辨率设定为70 000 FWHM，自动增益控制的目标值(AGC)设定为10×106，二级扫描模式Full MS/dd-MS2分辨率设定为17 500 FWHM，AGC为50×105，TOP 5模式.

2 结果与讨论

2.1 色谱方法的优化

2.1.1 色谱柱的选择

色谱柱采用Thermo Scientific Hypersil Gold系列，填料颗粒为1.9μm表面多孔实心核.实验考察了Hypersil Gold系列中C18、C8和aQ这3种不同选择性的超高效液相色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9μm)，三种柱子都是将优化的长链烷基键合于多孔硅胶表面，Hypersil Gold C18色谱柱pH工作范围为1～11，载碳量为10%；Hypersil Gold C8为中等极性分析柱，pH工作范围为2～9，载碳量为8%；C8分析柱比C18分析柱提供更高的分析通量，疏水性弱于C18柱，化合物能更快地从多硅胶层中洗脱出来；Hypersil Gold aQ色谱柱，pH工作范围为2～9，载碳量为12%，固定相为中端极性封端的C18键合多孔硅胶，在键合相为单纯的碳链时，分配机制为主要的保留机制，促使在C18键合相上无保留或保留弱的极性目标分析物得以保留.

实验中灭多虫(Methomyl)、多菌灵(Carbendazim)、草特灵(Isocarbamid)、毒草安(Propachlor)、莠灭净(Ametryn)和唑虫酰胺(Tolfenpyrad)的加标浓度为10μg/kg，以巴氏杀菌乳为基质，进行前处理后，以目标化合物峰面积为考察指标，结果(如图1所示)表明采用Hypersil Gold aQ色谱柱对不同类型的分析物分离效果好，对于杂质和目标化合物的分离能力强，C8分析柱对于毒草安中等极性分析物保留较好，对灭多虫和多菌灵极性较强的目标分析物保留能力较弱，aQ分析柱中极性官能团引入键合相，增加了反向基质的水可润性，可用于100%水溶液流动相，而不会造成“疏水塌陷”，此外aQ分析柱屏蔽了残余的硅醇基，确保了所有类型分析物都具有较高的分离度与灵敏度.

图1 6种农药经不同色谱柱分离的色谱峰响应值(n=6)

2.1.2 流动相的优化

实验分别以不同浓度甲酸-甲酸铵和乙酸-乙酸铵作为流动相缓冲体系考察目标分析物响应值，以巴氏杀菌乳为基质，加标浓度为10μg/kg，以灭多虫(Methomyl)、多菌灵(Carbendazim)、草特灵(Isocarbamid)、毒草安(Propachlor)、莠灭净(Ametryn)和唑虫酰胺(Tolfenpyrad)为例，从图2中可以看出，两种缓冲体系都在0.1%酸量与4 mmol/L盐量时获得最佳效果，从图3可以看出，在以巴氏杀菌乳为基质时，甲酸-甲酸铵体系比乙酸-乙酸铵体系的离子化效果好.因此确定以0.1%甲酸+4 mmol/L甲酸铵水溶液和0.1%甲酸+4 mmol/L甲酸铵甲醇溶液为流动相.

(a)甲酸-甲酸铵缓冲体系

(b)乙酸-乙酸铵缓冲体系图2 6种农药在不同缓冲体系组合下的色谱峰响应(n=6)

图3 6种农药在两种缓冲体系下的色谱峰响应(n=6)

2.2 质谱方法的优化

目标化合物在四极杆-轨道离子阱质谱中的离子传输轨迹如图4所示，在离子束经透镜聚焦后进入四极杆时，若离子的质荷比在四极杆设定的质荷比范围内，则通过八级杆聚焦后进入C-Trap，C-Trap中的真空度为4.0×10-10，低于轨道离子阱质谱的真空度2.4×10-10，当C-Trap中离子数目累积至设定的AGC即10×106时，离子通过真空度压差进入轨道离子阱，轨道离子阱运用静电场实现离子分离与质荷比测定.二级扫描在全扫描的基础上得到更具针对性的碎裂片段数据，单位分辨率的四极杆将信息列表中的离子传输至C-Trap，C-Trap将离子压缩后进入加有电压的碰撞池，分子离子在电压势能的推进下高速运动，与压力为0.8 MPa的高纯氮气碰撞，断裂为碎片离子.

若在同一时间段多个色谱峰满足碎裂条件，打碎色谱峰的数目由TOP N确定(同一时间打碎响应值较高的N个分子离子)，理论上N=Multiplex×Loop Count，其中Multiplex为增益值，实验中对测定峰响应值不进行放大，即Multiplex设定为1.当设定Loop Count等于3，即采用TOP 3采集模式，三种共流出化合物甲氧噻草胺、溴丁酰草胺、三嗪茚草胺的保留时间分别为8.66 min、8.67 min、8.67 min，四极杆-轨道离子阱质谱仪依次对三种化合物的分子离子进行了一次全扫描和三个分子离子的碎片进行了一次二级片段扫描.随着N的增大，二级碎片质谱扫描信息(准确性)逐渐丰富，但用于每个片段的扫描时间(精确性)逐渐减少，实验中，对Loop Count的设定进行了优化，当采用TOP 5模式时，实验结果的准确性与精确性满足巴氏杀菌乳中农药残留分析工作的需要.

图4 四极杆-轨道离子阱质谱仪离子轨迹

2.3 前处理方法优化

分散固相萃取前处理方法的本质为样品稀释的过程，回收率的主要影响因素为除水剂及用量选择、缓冲体系的选择和固体分散净化剂的选择与用量，实验中对以上参数进行了考察.

2.3.1 除水剂及用量选择

分散固相萃取前处理方法中，使用无水硫酸钠或无水硫酸镁除去经氯化钠盐析重新分配到有机萃取相中的水分.实验中除水剂无水硫酸钠或无水硫酸镁的使用量都为6.0 g，以灭多虫(Methomyl)、多菌灵(Carbendazim)、草特灵(Isocarbamid)、毒草安(Propachlor)、莠灭净(Ametryn)和唑虫酰胺(Tolfenpyrad)的回收率为研究指标，加标水平为10μg/kg，考察无水硫酸钠和无水硫酸镁对目标农药化合物提取效率的影响.从图5可以看出，使用无水硫酸镁时目标化合物的回收率高于无水硫酸钠.

图5 2种分散固相萃取样品前处理方法对10 μg/kg加标巴氏杀菌乳样品的回收率比较(n=6)

以灭多虫(Methomyl)、多菌灵(Carbendazim)、草特灵(Isocarbamid)、毒草安(Propachlor)、莠灭净(Ametryn)和唑虫酰胺(Tolfenpyrad)的回收率为研究指标，加标水平为10μg/kg，考察无水硫酸镁用量对目标农药化合物提取效率的影响.由图6所示，无水硫酸镁的使用量为6.0 g时，目标化合物的回收率较好.

图6 6种农药在不同无水硫酸镁使用量下的回收率比较(n=6)

2.3.2 缓冲体系的选择

在已颁布的官方标准中，分散固相萃取前处理方法通过使用乙酸-乙酸钠或倍半水合柠檬酸二钠-二水合柠檬酸钠缓冲体系使萃取环境的pH值变化控制在一定范围内，防止酸性或碱性不稳定目标物质在样品提取与净化过程中因体系离子强度与pH变化造成分解.实验对缓冲盐体系种类与使用量进行了研究.以酸环境不稳定农药草特灵(Isocarbamid)与毒草安(Propachlor)、碱环境不稳定农药灭多虫(Methomyl)与唑虫酰胺(Tolfenpyrad)、酸或碱环境均不稳定农药莠灭净(Ametryn)与酸和碱都稳定的农药多菌灵(Carbendazim)为目标化合物，选择巴氏杀菌乳基质，加标水平为10μg/kg，以6种目标分析物的回收率作为缓冲盐体系选择的评价指标.由图7所示，萃取环境构成缓冲体系后，前处理过程pH变化在一定范围内，为提高酸环境不稳定农药、碱环境不稳定农药、酸或碱环境均不稳定农药的稳定性，实验选择乙酸-乙酸钠缓冲盐体系.

图7 3种分散固相萃取样品前处理方法对10 μg/kg加标巴氏杀菌乳样品的回收率比较(n=6)

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线、线性范围与相关系数

精密移取24种农药的混合标准品储备液，配制浓度为0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、40、80、100、200、400、500μg/kg的混合标准物质溶液.以标准物质浓度(μg/kg)为横坐标，农药残留定量离子色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准物质校准曲线.线性结果(如表1所示)显示，各农药残留物质在各自线性范围内，相关系数(r2)均大于0.99，线性关系良好.

2.4.2 准确性和精密度

24种农药残留物质的确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别为0.04 ～4.2μg/kg与0.07 ～7.27μg/kg.通过回收率评价实验的准确性.利用6次平行实验的回收率结果的相对标准偏差来评价实验的精密度，在巴氏杀菌乳中添加CCβ、2倍CCβ和4倍CCβ的农药残留物质的系列混合标准物质溶液，按照1.3.2的步骤处理后检测分析，结果如表1所示.24种农药残留物质的平均回收率与相对标准偏差分别为78%～110%和0.8%～7.4%，在方法准确性和精密度均满足定量分析的要求，同时均低于已发表文献[19]对于乳制品中农药多残留检测结果.

表1 巴氏杀菌乳中24种农药的线性范围、确定限、检测容量、相关系数、平均回收率及精密度(n=6)

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱质谱联用快速分析测定巴氏杀菌乳中24种农药残留的方法，同时采用优化的分散固相萃取法对样品进行前处理.对实验的标准曲线、准确度、精密度方面进行了验证，结果均满足定量分析的要求，能满足目前乳制品中对多种农药残留分析的要求.