陆海涛，李雪飞，刘利君，何磊，段昕所

黑色素瘤病因不明，已成为发病率增长最快的恶性肿瘤，具有高度的转移性和侵袭力，且预后差［1-2］。顺铂是治疗多种肿瘤的一线用药，但肿瘤细胞对顺铂的耐药性可明显削弱其疗效［3］。肿瘤的基因治疗越来越受到关注，已经成为当前研究的热点。有研究表明，T-钙黏蛋白可抑制黑色素瘤的增殖和侵袭力，促进肿瘤细胞的凋亡［4-5］。另有研究认为，上调肿瘤的某些钙黏蛋白分子表达可提高肿瘤细胞对细胞毒性药物的敏感性［6］。T-钙黏蛋白能否逆转耐药黑色素瘤细胞对顺铂的敏感性，尚鲜见相关报道。本研究拟建立对顺铂耐药的黑色素瘤细胞株（CDDP-R B16F10），并转染T-钙黏蛋白基因获得稳定表达T-钙黏蛋白的黑色素瘤顺铂耐药株，观察T-钙黏蛋白联合顺铂对肿瘤细胞迁移及侵袭能力的影响。

1 资料与方法

1.1 主要试剂与仪器 黑色素瘤B16F10细胞株由吉林大学白求恩医学部提供。Transwell 侵袭实验用细胞外基质胶（extracellular matrix gel）和顺铂购自Sigma 公司。T-钙黏蛋白一抗购自Santa Cruz公司。T-钙黏蛋白二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 pEGFP-N1、脂质体2000（LipofectamineTM2000）和 TRIzol 购自 Invitrogen 公司。AMV反转录试剂盒、Taq 酶购自生工生物工程（上海）股份有限公司。孔径为8µm的transwell小室购自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 黑色素瘤B16F10顺铂耐药细胞株（CDDP-R B16F10）的建立及增殖能力测定 （1）细胞培养。B16F10 细胞株在37 ℃、5%CO2及10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基内生长，采用大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法诱导。取对数生长期B16F10 细胞，1 mg/L 顺铂作用24 h 后换为正常RPMI-1640 培养基，当细胞恢复生长后再加药，如此反复诱导、换液，最终使B16F10细胞能够在含有1 mg/L顺铂的培养基中正常生长。再依次加入含有2、4 mg/L 顺铂的RPMI-1640培养基，重复上述步骤，最终使得B16F10细胞能够在含有 4 mg/L 顺铂的 RPMI-1640 培养基中正常生长。（2）MTT 法检测CDDP-R B16F10 的增殖能力。取前述培养后细胞，分为CDDP-R B16F10细胞组和B16F10组（未发生顺铂耐药）。细胞以2×105/mL 的密度接种于96 孔板，每孔加入100 µL 细胞悬液。采用MTT 法，每日各组测定5 个孔的光密度（OD）值，连续4 d后绘制肿瘤细胞的生长曲线。

1.2.2 T-钙黏蛋白基因转染CDDP-R B16F10及筛选 取对数生长期的细胞，应用LipofectamineTM2000 将pEGFP-N1 空载体及本实验室构建的T-钙黏蛋白真核表达载体pEGFPN1-T-cadherin 转染 CDDP-R B16F10 细胞［7］。pEGFP-N1 质粒携带G418抗性基因，上述细胞培养48 h后加入G418，使其药物浓度为800 mg/L，进行筛选，2周后获得可稳定表达T-钙黏蛋白的CDDP-R B16F10细胞。采用有限稀释法挑选转染成功的单个细胞，反复筛选和传代，挑选在抗性培养基中生长良好的细胞。

1.2.3 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测转染后T-钙黏蛋白mRNA 的表达 按照Trizol 试剂说明书抽提细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度，逆转录为cDNA后行PCR反应。PCR 反应体系为50 µL：5 µL 10×Reaction Buffer，上、下游引物（10 µmol/L）各 1 µL，2 µL 模板 cDNA，4 µL dNTPs（2.5 mmol/L），0.5µL Taq Plus，36.5 µL双蒸水。引物序列见表1。反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 45 s，34 个循环；最后 72 ℃ 5 min。PCR 的产物用1.0%琼脂糖凝胶（含0.5µg/mL溴化乙锭），70 V，电泳2 h，凝胶成像系统照相，进行分析。

Tab.1 Primer sequence of each purpose gene表1 各自的基因引物序列

1.2.4 免疫组化SP法检测转染后T-钙黏蛋白的表达 取对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化，稀释成浓度1.5×105/mL。将细胞悬液滴加至载玻片，每孔0.2 mL，放置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。待细胞贴壁后，甲醇固定。3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，胎牛血清封闭非特异性抗原，一抗4 ℃过夜，二抗37 ℃1 h，DAB 显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，自来水冲水返蓝，中性树脂封片，拍照观察T-钙黏蛋白的表达情况，在细胞质、细胞核、细胞膜出现棕黄色视为T-钙黏蛋白阳性。

1.2.5 Wound-healing 划痕实验检测肿瘤细胞的迁移情况 肿瘤细胞接种到6 孔板，每孔的培养体积为3 mL，细胞密度约5×105/mL，5%CO2、37 ℃、饱和湿度条件下孵育12 h。用200µL 移液器在已经铺满的单层细胞上划痕，PBS 清洗3次，洗掉漂浮的细胞，实验分为6组。（1）空白对照组（CDDPR B16F10细胞）。（2）pEGFP-N1组，转染pEGFP-N1空载体。（3）pEGFP-N1-T-cadherin组，转染pEGFP-N1-T-cadherin。（4）顺铂组，培养基加入顺铂，终浓度4 mg/L。（5）pEGFP-N1联合顺铂组，转染pEGFP-N1 空载体，并加入顺铂，终浓度4 mg/L。（6）pEGFP-N1-T-cadherin 联合顺铂组，转染pEGFPN1-T-cadherin，并加入顺铂，终浓度4 mg/L。在培养0 h、24 h拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次。

1.2.6 Transwell 侵袭实验检测肿瘤细胞侵袭力 实验分组同1.2.5。参照文献［8］，调整细胞密度至2×105/mL，取200 µL加入上室，空白对照组、pEGFP-N1组和pEGFP-N1-T-cadherin组的上室为无血清RPMI-1640 培养基，顺铂组、pEGFP-N1联合顺铂组和pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组上室为含4 mg/L顺铂的无血清RPMI-1640培养基。6组的下室均加入600µL 含30%血清的培养基。24 h 后取出小室，PBS 洗2遍，棉签擦去ECM 胶和上室内的细胞，100%甲醇固定15 min，苏木素染色，显微镜下观察，随机抽取5 个视野计数，取每组的平均值表示肿瘤细胞的穿膜细胞数。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.5软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，析因分析确定各因素的单独效应及有无交互作用。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黑色素瘤顺铂耐药细胞株（CDDP-R B16F10）培养结果 成功建立黑色素瘤顺铂耐药细胞株。MTT法结果显示，在不含有顺铂的培养液中，CDDPR B16F10组和B16F10组的生长趋势相近，见图1。

Fig.1 Proliferative ability of CDDP-R B16F10图1 CDDP-R B16F10的增殖能力

2.2 细胞转染效率 转染24 h 后，pEGFP-N1-T-cadherin 和pEGFP-N1 空载体的转染效率分别为（31.02±2.83）%和（35.62±3.35）%,差异无统计学意义（t=2.35，P＞0.05），见图2。

2.3 转染后T-钙黏蛋白mRNA 的RT-PCR 检测结果 转染 pEGFP-N1 -T-cadherin 的 CDDP-R B16F10 细胞扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈明显条带，其大小为208 bp，内参对照β-actin 片段大小为435 bp，证实T-钙黏蛋白成功转染于肿瘤细胞，见图3。

2.4 转染后T-钙黏蛋白的免疫组化SP 法检测结果 转染 pEGFP-N1-T-cadherin 的 CDDP-R B16F10 细胞的T-钙黏蛋白呈阳性表达。未转染的CDDP-R B16F10 细胞、转染 pEGFP-N1 空载体的CDDP-R B16F10细胞T-钙黏蛋白的表达均呈阴性，见图4。

Fig.2 The expression of green fluorescence in cells under fluorescence microscope图2 荧光显微镜下细胞内绿色荧光的表达情况

Fig.3 The expression of T-cadherin mRNA图3 T-钙黏蛋白mRNA的表达情况

2.5 Wound-healing 划痕实验检测肿瘤细胞迁移情况 T-钙黏蛋白可抑制黑色素瘤细胞及其顺铂耐药细胞迁移（P＜0.05）。T-钙黏蛋白与顺铂联合对耐药细胞迁移的抑制有交互作用（P＜0.05），见图5、表1。

2.6 Transwell 侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭能力 T-钙黏蛋白可抑制黑色素瘤细胞及其顺铂耐药细胞的侵袭力（P＜0.05）。T-钙黏蛋白与顺铂联合对耐药细胞侵袭力的抑制有交互作用（P＜0.05），见图6、表1。

3 讨论

侵袭转移是肿瘤脱离原发灶，到达远处继续生长，并形成转移灶的过程，是影响肿瘤患者预后的重要因素。钙黏蛋白的表达降低会导致细胞间黏附功能丧失，使细胞易脱落，从而造成肿瘤的转移，因此，其在多种肿瘤的增殖、迁移过程中起重要的作用。相关研究发现，上调某些钙黏蛋白分子可提高肿瘤对细胞毒性药物的敏感性［9-10］。T-钙黏蛋白属于钙黏蛋白超家族。目前，相关研究已经在人类乳腺癌［11］、肺癌［12］等多种恶性肿瘤中检测到T-钙黏蛋白的表达异常。有研究表明，T-钙黏蛋白在黑色素瘤中的表达缺失可阻碍肿瘤细胞的凋亡［13］。T-钙黏蛋白可通过抑制β1整合素来降低肿瘤的侵袭性［14］。因此，T-钙黏蛋白被认为是一种抑癌基因。顺铂为细胞周期非特异性细胞毒性药物，作为传统的肿瘤化疗药物，已经在多种肿瘤治疗中出现耐药性。耐药是一个多因素参与、多基因作用的复杂过程，如药物去活作用增强，进入细胞内药物的减少［15］，DNA损伤修复［16］和凋亡通路以及一些间接信号通路的变化等。

Tab.1 The effects of T-cadherin combined with cisplatin on migration and invasion of CDDP-R B16F10表1 T-钙黏蛋白联合顺铂对CDDP-R B16F10迁移和侵袭力的影响 （n=3，±s）

Tab.1 The effects of T-cadherin combined with cisplatin on migration and invasion of CDDP-R B16F10表1 T-钙黏蛋白联合顺铂对CDDP-R B16F10迁移和侵袭力的影响 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a 与 pEGFP-N1-T-cadherin组比较，b 与 pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组比较，P＜0.05

组别空白对照组pEGFP-N1组pEGFP-N1-T-cadherin组顺铂组pEGFP-N1联合顺铂组pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组F基因转染F顺铂F交互细胞迁移率（%）67.90±1.54ab 68.33±1.96ab 51.87±1.56b 67.97±1.21ab 68.43±0.59ab 20.60±1.18 1 034.589＊245.416＊249.377＊穿膜细胞数（个/视野）23.67±1.53ab 24.00±1.73ab 12.67±0.50b 23.33±2.52ab 23.00±2.65ab 4.33±0.58 139.655＊14.500＊9.172＊

本研究成功建立黑色素瘤顺铂耐药株CDDP-R B16F10。将构建的pEGFP-N1-T-cadherin 质粒转染CDDP-R B16F10 后结果显示，pEGFP-N1-T-cadherin 联合顺铂组细胞迁移率及穿膜细胞数均低于其他组，且T-钙黏蛋白与顺铂联合对CDDP-R B16F10的迁移与侵袭力的抑制均有正交互作用，表明T-钙黏蛋白联合顺铂可抑制CDDP-R B16F10 的迁移和侵袭能力，T-钙黏蛋白与顺铂联合有协同抗肿瘤作用，考虑可能原因为T-钙黏蛋白在肿瘤细胞重新表达，恢复了细胞间的黏附作用，也可能通过T-钙黏蛋白的信号传递功能［13］，最终降低了CDDPR B16F10的侵袭能力。

另外，有研究显示PI3K/AKT信号通路可以通过补偿顺铂引发的致死信号，从而导致耐药性的产生［17］。作为一种肿瘤抑制因子，T-钙黏蛋白可拮抗PI3K/AKT 信号通路［13］。笔者将 T-钙黏蛋白转染CDDP-R B16F10 后，可能阻断了上述补偿通路，从而恢复了顺铂对CDDP-R B16F10 迁移及侵袭力的抑制作用。这为肿瘤的联合治疗及解决肿瘤化疗中耐药性的问题提供了思路。T-钙黏蛋白逆转肿瘤耐药性的机制，以及T-钙黏蛋白联合顺铂后所表现出的协同抗肿瘤的作用机制有待进一步研究和证实。此外，T-钙黏素主要介导肿瘤细胞间黏附，其表达定位于胞浆和胞核，出现胞核的易位可以作为日后研究的方向；过表达T-钙黏素后，可观察肿瘤细胞间连接通讯情况以及细胞内药物检测；另外耐药株过表达T-钙黏素后抑制迁移和侵袭，可通过检测细胞增殖和凋亡以及药物敏感情况加以验证，这些均可以作为研究的方向。

Fig.4 The expression of T-cadherin protein(immumohistochemical staining,×400)图4 T-钙黏蛋白的表达情况（免疫组化染色，×400）

Fig.5 The effect of T-cadherin combined with cisplatin on migration of CDDP-R B16F10(×100)图5 -钙黏蛋白联合顺铂对CDDP-R B16F10迁移的影响（×100）

Fig.6 The effect of T-cadherin combined with cisplatin on invasion of CDDP-R B16F10(hematoxylin staining,×200)图6 T-钙黏蛋白联合顺铂对CDDP-R B16F10侵袭力的影响（苏木素染色，×200）