王珏，黄娟，许蕊



利用CRISPR/Cas9和实现果蝇基因组无缝编辑

王珏，黄娟，许蕊

南京医科大学基础医学院医学遗传学系，南京 211166

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)是第三代基因组编辑技术。在sgRNA引导下，Cas9核酸内切酶作用于特定基因组序列，产生DNA双链断裂(double-stranded breaks, DSBs)，利用同源定向修复(homology-directed repair, HDR)可实现对靶基因的特异性基因敲除(knock-out)或敲入(knock-in)。传统的技术方案将CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用，可实现高效的基因打靶，也易于移除打靶过程中引入的筛选标记。然而，筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列。因此，对基因组进行精确编辑的同时不引入无关序列仍有一定难度。在人工诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的基因组编辑中，CRISPR/Cas9技术和转座酶联用的两步法策略能够实现这一目标：首先运用CRISPR/Cas9技术，利用同源定向修复原理引入基因突变及筛选标记，然后利用转座酶将筛选标记精确移除。借鉴该方法的技术原理，本研究对果蝇()基因进行了无缝编辑(seamless genome editing)，成功将该基因第18外显子上第21位的酪氨酸(tyrosine, Y)突变为半胱氨酸(cysteine, C)，且测序结果显示基因组中除设计位点之外并无其他外源序列残留。CRISPR/ Cas9技术和转座酶联用策略为果蝇基因组的精确编辑提供了更多选择。

果蝇；无缝基因组编辑；CRISPR/Cas9；

利用现代生物学技术获得基因突变体，并检测基因突变造成的影响是研究基因功能的重要手段。CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated pr­otein 9)技术的出现和应用，为实现基因打靶提供了简单高效的方法[1~3]。在sgRNA引导下，Cas9核酸内切酶可作用于特定基因序列，产生DNA双链断裂(double-stranded breaks, DSBs)，诱发内源性非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源定向修复(homology-directed repair, HDR)。……