孟溪

（中冶华天工程技术有限公司，江苏南京 210009）

藻类是地球上的初级生产者，广泛分布于海洋、淡水河湖中。藻类可以通过光合作用将大气中的二氧化碳固定为有机碳并生成氧气，从而平衡大气组分；也可以通过化能异养吸收环境中的氮磷等营养物，降低富营养化程度。虽然藻类作用巨大，但环境体系内如果过量，形成藻化和赤潮，便会危害水质、破坏环境。我国太湖及滇池水化严重，国家已投入大量人力及财力进行治理。对于藻类资源的开发利用，国内外已有许多应用案例。例如，褐藻中的海带、红藻中的紫菜均属于常见的食用藻类，富含多种微量元素，有益人体健康；褐藻中含有的藻胶酸钙盐可以用于生产人造羊毛、止血药等医药产品；念珠藻、鱼腥藻具有固氮能力，可以用来增强土壤的肥力；藻类细胞中的生物酶受到重金属抑制后，会导致细胞突变、坏死，也可用来检测水中重金属的浓度。综上所述，藻类可用于食品、医药、农业、环保等领域，具有一定的经济价值。

为了研究和开发利用藻类资源，准确快捷的鉴定分类方法在持续发展。人类最早只能通过肉眼观察藻类的大规模活动，显微镜的发明使得微观层面研究分析变成了可能。随着光学仪器的发展，高效液相色谱仪、流式细胞仪已成为藻类多样性分析的主要技术手段。通过分析藻类的细胞色素等一些光学特征，可以得出定性及定量的结果，效率远高于形态学镜检。随着20世纪80年代，分子水平研究的迅猛发展，三域学说的提出，使得DNA分子鉴定方法逐渐成为一种新的藻类多样性研究方法，其在准确性、鉴定成本、通量方面都有着较大的优势。以上这些方法虽然诞生时间不同，发展速度差异较大，但具有不同的优缺点，需要根据目标藻类的特征进行合理的选择。表1列举了常用的藻类鉴定分析的技术及其特点。

2 形态学

不同藻类的细胞壁结构具有差异，某些类群还具有特有的钙盐、硅酸盐外壳，因而形态差异巨大。这种差异具有类群特性，借助显微镜可以进行藻类的鉴定和计数统计。观察浮游生物的形态，开创了最早的藻类鉴定及分类体系。赫克尔应用显微镜首次详细地描述记录了硅藻或者放射虫等含有硅质生物体藻类的形态。通过形态学进行藻类鉴定至今仍是一种重要的技术手段，对于体积较大的藻类（直径大于10 μm），并且具有特征形态，便于显微镜观察，形态学镜检已成为首选方法。

表1 藻类鉴定分析常用方法

藻类大多含有特征性的细胞色素，种类特异性高，具有特征吸收波长。早期根据藻类颜色划分为红藻、绿藻、棕藻、硅藻四大类群。藻类的光学特征也属于形态学的一部分，其色素组成、细胞外形、内含物结构都存在类群特异性。虽然这种基于光学特征的方法很难精确鉴定到物种，但在纲、目等较高分类水平上则十分精确，结合分析仪器，可以简单快捷地分析鉴定环境藻类样品。目前，应用较广的是高效液相色谱法和流式细胞仪法。

2.1 高效液相色谱

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）能够同时分析藻类的种类与数量，根据检测出的色素丰度可以推测出各个特异性色素所属类群的相对比例。由于色谱法相对较高的通量以及成本花费较低，大规模环境样品的分析十分流行，能够鉴定绝大多数藻种的分类信息。联合国教科文组织所推荐的Wright方法是利用HPLC分析藻类多样性的典型代表，可进行40多种类胡萝卜素和12种叶绿素的鉴定。我国学者先后利用HPLC色素分析方法在厦门海域、东海等地研究了浮游藻的种类特征[2,7]。

2.2 流式细胞仪

流式细胞仪是基于藻类的光学特征进行环境藻类样品的分析和鉴定。藻类单细胞排列形成一束液流，液流中的细胞经过一束激光照射而产生散射光。这种散射光与细胞的体积、形态、胞内物质组成和结构具有相关性，分析散射光谱特征便可分析鉴定藻类的多样性。Trask[3]利用流式细胞仪研究了8种分属于5纲的不同纯培养藻类，也发现了不同类型藻类由于大小和色素含量的差异，其叶绿素等荧光强度呈现多样化，需结合多种色素同时鉴定，才能得出较为精确的结果。我国学者徐兆安[4]通过流式细胞仪，成功分析了太湖藻类的多样性组成，可处理浓度高达100万个/L藻类细胞的水体。流式细胞仪在较小细胞体积（细胞＜20 μm）的藻类上应用最为成功，他们的细胞基本为球状，且易形成单细胞液流，检测过程稳定，便于进行定性及定量分析[1]。

3 分子鉴定方法

在进入21世纪，许多研究领域开始进入分子特征描述阶段。DNA测序技术进入了快速发展期，从最早的Sanger测序到现在成熟的高通量测序，其测序成本逐渐降低，分析通量呈指数级提高。分子鉴定方法，首先需要选取被鉴定物种所含有的标记基因，通过DNA测序进而进行序列的相似度比对，进而分析被检测类群的多样性。结合高通量测序的分子鉴定方法已成为藻类多样性研究的主要技术手段。

3.1 标记基因

标记基因主要是用来分析物种之间相似度和亲缘关系。现今生物分类主要根据“三域学说”进行划分，根据SSU rDNA基因的差异，可将地球上的生物分类为原核生物，真核生物、古生菌三个类群。藻类的分类鉴定通常选取rDNA基因和某些功能基因，如光合基因[8]。国内外已有很多学者，如甄毓[5]、王高鸿[9]等人，通过藻类的rDNA及功能基因成功地进行藻类的分子鉴定及多样性研究，得出了精准快捷的分析结果。

3.2 DNA测序方法

基因测序技术的快速发展使得分子层面的多样性分析更为便捷。DNA测序方法从最早的Sanger测序（末端终止法），到现在广泛使用的高通量测序，其测序速度和通量都呈现出指数级增长。Sanger测序的优势为片段长度适中、测序质量高，但是经济费用高以及低通量仍然是其缺点。在现如今的藻类多样性分析中，高通量测序已逐渐取代了Sanger测序，其价格成本、测序通量都在发生了革命性的变化。王靖淇[6]、毕宏伟[10]等人已成功使用高通量测序技术分别对我国辽河及东湖水域进行了藻类多样性的分析和鉴定，并成功探究藻类分布与环境因子的相关性。随着高通量测序的快速发展，这种技术手段会更多地应用于环境藻类样品的鉴定及多样性分析中。

4 小结

形态鉴定和分子鉴定方法是区分藻类的两种主要方法，都是基于藻类的特征进行多样性研究。两种鉴定方法都各有优势，但由于标准不一样，不同方法得出的藻类之间亲缘关系仍存在一些分歧。这种现象可能是分子鉴定所选取的标记基因不太合适，无法在各个分类层级上完美表达遗传关系，也可能是因为形态学鉴定存在一些认识不足。在未来，随着测序技术的发展以及分类计算方法的优化调整，分子鉴定在藻类资源研究中的应用也会逐渐增多，成为主要的技术手段。