刘娜，李文谦

（淮阴工学院，江苏淮安 223003）

磷是植物生长发育必需的营养元素之一，在土壤中含量较高，但绝大多数不能被植物直接吸收利用。我国74%的耕地土壤缺磷，土壤中无效磷占了95%以上[1]。因此，必须向土壤中施入大量可溶性磷肥，以提高作物产量，但当季磷肥利用率较低，为5%～10%[2]，大部分磷与Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+结合形成难溶性磷酸盐，作物难以利用，使得磷元素在土壤中大量积累，降低磷利用率并带来严重的环境污染。

土壤中存在许多微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，具有这种能力的微生物叫做解磷菌或溶磷菌（Phosphate-solubilizing microorganisms）[3]。本文对枯草芽孢杆菌的培养条件进行优化，以达到相对较高的解磷能力和生长量，为利用解磷菌提高土壤中磷利用率提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

枯草芽孢杆菌，在实验室沙土管保藏菌种。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏5g/L、氯化钠5g/L，调节pH为7.4～7.6。

解磷液体培养基：蔗糖10g/L、磷酸钙10g/L、氯化钠0.3g/L、氯化钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸亚铁0.03g/L、硫酸锰0.03g/L、硫酸铵0.5g/L、酵母提取物0.5g/L，pH7.2，115℃灭菌 20min。

碳源培养基：将解磷培养基中的碳源分别替换成蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖，其他成分保持不变。

氮源培养基：将解磷培养基中的氮源分别替换成硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠和尿素，其他成分保持不变。

重金属离子培养基：在液体解磷培养基中分别加入 Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+金属离子，其浓度保持一致。

1.1.3 仪器设备

主要有紫外分光光度计（UV-1800上海印溪仪器仪表有限公司）、分析天平（FA2004 上海菁海仪器有限公司）、电子天平（TD5002G 天津天马衡基仪器有限公司）、超净工作台（BCM-1000 苏州净化设备有限公司）、灭菌锅（YM100Z 100L 上海三申医疗器械有限公司）、恒温培养摇床（HYL-B太仓市强乐实验设备有限公司）、pH计（E-201-C上海仪电科学仪器股份有限公司）等。

1.2 试验方法

1.2.1 吸光度值与菌体浓度标准曲线

收集发酵液后测定其吸光度值，利用比浊法（600nm）测定[4]，然后离心称重，得到细菌的湿重。再烘干称重得到其干重。以菌浓度为纵坐标，吸光度为横坐标作标准曲线，结果见图1。菌浓度标准曲线回归方程为y=0.5503x-0.1183，回归系数R2=0.9898，含水量约为10%。

图1 菌浓度标准曲线

1.2.2 枯草芽孢杆菌菌体生长量测定

取微量被保藏于沙土中的解磷菌到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，在适宜条件下培养，通过分光光度计测定吸光度，以1.2.1计算得出菌浓度。以时间为横坐标，菌浓度为纵坐标绘制生长曲线，据此确定菌株在发酵培养中的最佳接种时间。

1.2.3 液体培养条件下溶磷能力测定

分别吸取5mg/L磷标准缓冲液0mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL于50 mL容量瓶中，加去离子水至30 mL，加钼锑抗试剂5 mL，摇匀，定容得浓度为 0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1.0mg/L溶液，静置约30min后，在700nm波长紫外分光光度计上进行显色比色，以磷质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制磷标准曲线[5]，结果如图2所示。钼锑抗磷标准曲线线性回归方程为y=0.5031x+0.0034，通过磷标准曲线计算溶液中有效磷含量，以确定菌株的溶磷能力。

图2 磷标准曲线（钼锑抗显色剂）

1.2.4 不同培养条件对解磷菌解磷能力的影响

1.2.4.1 最适温度的测定

（1）挑取微量被保藏于沙土中的解磷菌到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃活化12h时，之后取5 mL已活化的细菌菌悬液加入装有100 mL液体解磷培养基的锥形瓶中，重复10瓶，每两瓶为一组，并调节pH为7.0，分别在22℃、25℃、28℃、31℃、34℃，180r/min的摇床发酵培养24h。

（2）在600nm吸光度下读出数值，即为解磷菌的菌体浓度。重复多次，读出单因素的各组数值，整理数据并作图。

（3）使用钼锑抗分光光度法检测上清液中可溶性磷的含量。吸取5mL原液于50mL容量瓶中，加入约25mL蒸馏水，滴入一滴酚酞显色剂，逐滴加入浓度为0.1mol/LNaOH溶液，直至溶液变为粉红色。再加入5mL现配好的钼锑抗试剂，然后迅速定容到50mL标准刻度线，摇匀室温静置30min。然后用分光光度计于700nm处测出各样品吸光度，记录数据。在其他基础培养条件不变的情况下，分别以pH、碳源、氮源、金属离子、摇床转速为单因素设置不同的实验梯度。

1.2.4.2 最适pH条件的测定

调节pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在28℃，180r/min的摇床发酵培养24h。

1.2.4.3 最适碳源条件的测定

分别将碳源替换成蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖和葡萄糖，并调节pH为7.0，在28℃，180r/min的摇床发酵培养24h。

1.2.4.4 最适氮源条件的测定

分别将氮源替换成硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠和尿素，并调节pH为7.0，在28℃，180r/min的摇床发酵培养24h。

1.2.4.5 最适金属离子条件的测定

在液体解磷培养基中分别加入Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+几种金属离子，其浓度保持一致。

1.2.4.6 最适摇床速率条件的测定

在28℃，转速分别为140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min的摇床发酵培养24h。

1.2.5 正交试验确定解磷细菌的最适生长条件

根据单因素试验的试验结果缩小到一定范围，然后选择3个水平变量进行试验[6]，pH选择6.0、6.5、7.0三个梯度，碳源选择葡萄糖、果糖和蔗糖三种，氮源则选择硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾3种[7]。采用L9（33）正交设计试验对溶磷菌溶磷过程中最佳培养条件进行优化。种子液按5%接种量接种于培养基中，于28℃、180 r/min进行培养。利用比浊法（600nm）测定解磷菌的菌体浓度，钼锑抗比色法测定菌液中可溶性磷的含量。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线

如图3所示，2～12h为对数生长期，其菌浓度在12h处达到最大值，随后稳定在一定浓度。所以，实验选取活化12h后的菌种接入发酵培养基进行单因素以及正交试验[8]。

图3 枯草芽孢杆菌生长曲线

2.2 最适培养条件选择

2.2.1 温度对解磷菌生长量和解磷量的影响

根据图4所示，温度为22～28℃时菌浓度呈现上升趋势，在大约28℃时菌体的菌浓度达到最大值，表明在28℃时菌体生长量最多。同时溶液中的磷浓度在22～31℃呈上升趋势，所以28℃为该解磷菌种最适培养温度。

图4 温度对解磷菌生长量和解磷量的影响

2.2.2 pH对解磷菌生长量和解磷量的影响

根据图5所示，pH为5.5～6.5时，菌浓度以及磷浓度都呈现上升趋势，并且在pH6.5～7.5呈现菌浓度和磷浓度处于下降状态，由此可以得出，在pH6.5左右时为该解磷菌种的最适pH培养条件。

图5 pH对解磷菌生长量和解磷量的影响

2.2.3 碳源对解磷菌生长量和解磷量的影响

碳源是解磷微生物生长发育必需的因素之一[9]，糖类是最主要的碳源。糖类又可以分为单糖、二糖、多糖三种。根据图6数据所反映出的结果，葡萄糖和果糖两种单糖对解磷菌生长帮助最大，同时解磷效果也是最佳的，二糖对生长量的促进效果和对菌体的解磷效果不如单糖。所以，培养该菌种时应当选用单糖，其中葡萄糖效果最好。

图6 不同碳源对解磷菌生长量和解磷量的影响

2.2.4 氮源对解磷菌生长量和解磷量的影响

氮源也是解磷菌种必不可少的一种营养要素，图7的柱状图可以反映出几种氮源对解磷菌种的生长量以及其解磷效果的不同影响。其中，硫酸铵对生长量促进最大，其次是硝酸铵和硝酸钾，硝酸钠以及尿素的促进作用较差。

同样观察磷浓度，也能够直观地发现，硫酸铵对解磷微生物的解磷效力有着十分明显的促进作用，硝酸铵的促进作用第二，接下来分别是硝酸钾和硝酸钠，尿素的促进作用最差。由此可以确定，硫酸铵是最佳的氮源选择，不仅可以达到最多的菌体生长量，而且能使菌体大量溶解无机磷，从而达到最高溶磷量。

图7 不同氮源对解磷菌生长量和解磷量的影响

2.2.5 金属离子对解磷菌生长量和解磷量的影响

金属离子有着维持微生物生理功能的重要作用。它不仅构成了许多细胞的内部分子结构，并且能够调节生理物质对渗透压的稳定、pH的维持、以及对酶活力的调控。

从图8可以看出，Mg2+、Mn2+可以显著提高菌体生长量，而Fe2+对菌体生长量有着十分显著的抑制作用，Zn2+、Cu2+对其生长量并无太大影响。再通过对磷浓度的比较，发现Mg2+、Mn2+对解磷量也同样有着非常可观的促进作用，同样，Zn2+、Cu2+对解磷量没有明显影响，而Fe2+却有着抑制作用。因此在选择金属离子时，要注意添加合适浓度的Mg2+、Mn2+，避免高浓度的Fe2+对解磷菌产生抑制作用[10]。

图8 不同金属离子对解磷菌生长量和解磷量的影响

2.2.6 摇床速率对解磷菌生长量和解磷量的影响

根据图9可以看出，在140～180r/min菌体浓度明显呈现上升趋势，而在180～220r/min菌体浓度则呈现下降趋势，即当转速达到180r/min时菌体生长量达到峰值。再观察磷浓度曲线我们也可以发现相同的趋势，即当转速达到180r/min时，解磷微生物的溶磷量达到最大值。所以在选择转速时，应当选择180r/min进行培养。

图9 摇床速率对解磷菌生长量和解磷量的影响

2.3 正交设计试验结果分析

设计正交试验，因素A为pH（水平1为6.0，水平2为6.5，水平3为7.0）；因素B为碳源（水平1为蔗糖，水平2为果糖，水平3为葡萄糖）；因素C为氮源（水平1为硫酸铵，水平2为硝酸铵，水平3为硝酸钾）。结果见表1。

表1 不同因素对于解磷菌菌体生长量和解磷量的影响

由正交实验结果可知，多种因素对于解磷菌生长量的影响力大小分别为：碳源＞氮源＞pH值。通过表1可知，最佳培养条件是A2B3C1，即pH6.5条件下以葡萄糖为碳源并以硫酸铵为氮源，此时菌体生长量最佳为0.505g/L，磷浓度为0.780mg/L。

3 结论

（1）该解磷菌的生长周期约为24h，在12h时菌活力最好，所以应当选取活化12h后的菌液接入发酵培养基效果最好。

（2）培育该种解磷菌种所采用的最佳培养条件是：在28℃的条件下，pH6.5，碳源选择葡萄糖，以硫酸铵作为氮源，摇床速率选择180r/min，适量添加Mg2+、Mn2+离子，避免高浓度Fe2+离子，此时的解磷菌菌体生长量达到最大值。并且在相同条件下，解磷菌的解磷量也达到最大值，所以最适条件与上述各条件相同。

（3）由正交实验数据分析可知，多种因素对于解磷菌的菌体生长量和解磷量的影响力大小分别为碳源＞氮源＞pH值，即最佳培养条件是pH6.5条件下以葡萄糖为碳源并以硫酸铵为氮源，此时菌体的解磷效果最好，菌体生长量最佳为0.505g/L，磷浓度为0.780mg/L。