林伟国，吴冲冲，宗明生，谢婧新，于鹏，荣峻峰

（中国石化 石油化工科学研究院，北京 100083）

由于化石能源的逐渐减少和环境污染的日益严峻，人们迫切需要寻找新的清洁能源来替代传统能源。生物柴油具有环保性能好、发动机启动性能好、燃料性能好、原料来源广泛等特性，被视为主要的替代能源之一。目前，微藻是最具潜力的第三代生物能源原料，具有油脂含量高、生长速度快、不与粮食竞争、能产生多种高附加值产物、可消耗环境中的CO2等优点[1-3]。近年来，微藻生物柴油技术引起了国内外学者的广泛关注[4-5]，但由于成本及能耗高等原因，至今仍难达到规模化生产[6]。在微藻生物柴油的生产工艺中，油脂提取是关键环节之一，因此研发具有高效节能的油脂提取技术是降低成本的有效途径之一[7-8]。

微藻体积小且具有细胞壁结构，细胞破碎一直是目前利用微藻培养和提取微藻油脂的难点之一[9]。目前，微藻破壁提油常用的方法有物理法、化学法、生物法[10-12]。物理法包括高速高压均质法、超声法、反复冻融法等，这些方法各有优缺点，可以根据对最终产品需求的不同采用不同工艺提取微藻油脂。化学法常用的有机溶剂提取法虽较为温和，但所需时间长，且对部分坚硬藻油脂提取率较低[13]。生物法中水酶法是在水相中利用相关酶水解细胞壁，从而使油脂游离出来。该方法操作条件温和，安全，污染少，生产过程能耗低，所得到的油脂质量较高，生物相容性好，易于精炼，也可以用于处理湿藻，微藻采收后无需干燥，大大降低了能耗[14-16]。

本研究选用难以破壁提取油脂的微拟球藻和小球藻为研究对象，采用酸碱预处理与水酶法酶解微藻细胞相结合，高效提取微藻油脂，并考察了不同萃取溶剂对油脂提取率和提取油脂种类的影响，为微藻生物质的综合利用提供技术支持。

1 实验部分

1.1 样品与试剂

微拟球藻，烟台海融生物技术有限公司养殖；小球藻，石油化工科学研究院微藻实验室养殖；冰醋酸、乙醇、NaOH、三氯甲烷、正己烷，分析纯，购自北京化工厂；2 000 IU /g纤维素酶、20 000 IU/g果胶酶、50 000 IU/g酸性蛋白酶，购自北京鸿润宝顺科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 微藻油脂的提取

（1）水热法（酸热法）。称取3 g微藻干粉于烧杯中，加入30 mL水，搅拌均匀，加入浓盐酸控制反应体系中盐酸浓度为1 mol/L，在80 ℃下水浴加热2 h，降至常温，加入30 mL三氯甲烷萃取其中的微藻油脂，干燥脱除有机溶剂后得到微藻油脂。

（2）超声法。称取3 g微藻干粉于烧杯中，加入50 mL水，搅拌均匀，在冰浴条件下超声破碎，超声功率为800 W，超声时间为3 s，间歇5 s，处理15～30 min，再加入30 mL三氯甲烷萃取其中的微藻油脂，干燥脱除有机溶剂后得到微藻油脂。

（3）索氏抽提法。取称取3 g微藻干粉，研磨后转移至滤纸筒放入抽提器内安装妥当，注入抽提溶剂三氯甲烷至虹吸管高度以上，待抽提液流净后，再加入混合液至虹吸管高度的2/3处。用脱脂棉塞入冷凝管上口，打开冷凝管进水管，加热抽提。每小时回流7次。抽提8 h以上，至抽提管内的混合液无油迹为止。回收混合液，取下冷凝管和抽提筒，加热除尽抽提瓶中残余的混合液，将抽提瓶在105 ℃温度下干燥至恒重，抽提瓶增加的量即为微藻总脂的量。

（4）水酶法。称取3 g微藻干粉于烧杯中，加入10 mL水，搅拌均匀，用氢氧化钠调节pH到9，把藻液放入氧弹中，设置旋转烘箱温度为80～100 ℃，反应8 h。之后从旋转烘箱中取出氧弹，把藻液移入烧杯中，用醋酸调节pH到5，按照每种酶200 IU/g（微藻）的量加入纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶中的一种或者两种、三种组合，把藻液重新放回氧弹，在旋转烘箱内于50 ℃下反应10 h。反应结束后用有机溶剂萃取微藻油脂，干燥脱除有机溶剂后得到微藻油脂。

1.2.2 微藻油脂中可皂化物和不可皂化物的测量

准确称取干燥的微藻油脂样品约5 g（准确至0.000 1 g），记录其质量m1，放于斜三口圆底烧瓶中，加入1 mol/L的KOH-95%乙醇溶液50 mL，搅拌下加热回流2 h，皂化微藻油脂中的可皂化物；加入蒸馏水20 mL，冷却后加入25 mL正己烷分2次洗涤烧瓶，萃取分离皂化液中的不皂化物，萃取液用蒸馏水洗涤2次，并将洗涤水与斜三口圆底烧瓶中的萃余液合并，蒸出合并液中的乙醇，至烧瓶中无气泡为止；在60 ℃下用1.5 mol/L HCl溶液50 mL酸化合并液，反应时间为30 min，然后静置冷却；将酸化后的溶液转移至分液漏斗中，用20 mL正己烷洗涤烧瓶2次，并将洗涤液移入漏斗中静置分层，将下层甘油酸水转移到另一个500 mL分液漏斗中，加20 mL正己烷进行萃取，如此萃取2次后，将得到的正己烷溶液合并于一个分液漏斗中，用50 mL去离子水洗涤得到的脂肪酸，直至洗液加甲基橙指示剂不变色为止；将得到的脂肪酸正己烷溶液转移至旋转蒸发仪中，蒸发回收正己烷，干燥脂肪酸得到微藻油脂中可皂化的总脂肪酸质量（记录其质量m2）。

总脂肪酸含量（F）计算：

2 结果与分析

2.1 微藻油脂含量的标定

对微拟球藻和小球藻分别采用水热法、超声法和索氏提取法进行微藻油脂的提取，两种微藻得到的微藻总脂含量见表1。

从表1可以看出，采用不同方法提取的微藻油脂含量差异较大，分析原因，主要是不同方法对微藻的破碎提取效率有所差异，其中以索氏抽提法得到的微藻油脂含量最高，水热法次之，超声法最低。另外，不同批次的微藻油脂含量有所不同，这是因为微藻的养殖环境，如氮源、生长温度、营养盐等因素都对微藻中油脂的含量及组成有较大影响，由于原料的生产及供应条件，在以后的实验中使用序号为1、3的微藻作为实验原料。其中由于采用索氏抽提法提取的油脂较为充分，因此在以后的微藻油脂提取实验中均将水酶法提取到的微藻油脂与索氏抽提法提取的微藻油脂作对比。

2.2 纤维素酶对微藻油脂提取的研究

在微藻细胞壁中，内外层中均存在大量的纤维素及半纤维素等，纤维素酶可以降解微藻细胞壁中的纤维素骨架，崩溃细胞壁，使油脂游离出来[17]，因此首先采用纤维素酶对微藻进行酶解反应。采用纤维素酶对微藻酶解后所得到的油脂提取率见表2。

表1 索氏抽提法提取微藻油脂的含量

表2 纤维素酶对微藻酶解后的油脂提取率

从表2可以看出，与未加入纤维素酶的处理相比，加入纤维素酶后可以大幅提高两种微藻的油脂提取率，这说明加入纤维素酶有利于微藻的破壁。以微拟球藻为例，对微藻酶解前后进行扫描电镜（SEM）分析对照，酶解前后微拟球藻的SEM照片如图1所示。

从微拟球藻酶解前后的SEM照片可以看出，加入纤维素酶对微拟球藻酶解后，在扫描电镜视野中已基本没有完整的微藻细胞存在，微藻细胞已完全破碎，这说明加入酶可以达到使微藻细胞壁破碎，这有助于微藻油脂的提取。

图1 微拟球藻酶解前后SEM照片

2.3 酸碱预处理对微藻破壁油脂提取的影响

在微藻处理过程中，酸、碱既可以起到调节反应体系pH值的作用，同时又可以起到调节细胞壁内外化学环境、软化或降解纤维素等效果，因此，采用酸、碱辅助水热处理等手段对微藻溶液预处理是水酶法提取植物油脂常用的辅助手段[18-19]。加入酸或碱在80 ℃下对微藻预处理后8 h，再调节pH值至5.0后加入纤维素酶酶解微藻所得到的油脂提取率见表3。从表3可以看出，采用酸碱预处理两种微藻后，油脂提取率均明显提高，可见采用酸碱预处理方式是有效的。其中采用碱预处理两种微藻油脂的提取率均明显高于用酸预处理的，并也远高于单独使出碱预处理的，说明了碱预处理和纤维素酶酶解联合应用可更有效地将两种微藻油脂从细胞壁中游离出。在此后的微藻预处理过程中将采用碱预处理方式。

2.4 复合酶对微藻破壁油脂提取的影响

微藻的细胞壁成分除了纤维素、半纤维素，还含有果胶质、藻酸盐、藻多糖、聚半乳糖和硫酸酯等。而油脂在藻细胞内部通常与其他大分子结合，构成脂多糖和脂蛋白等复合体，并且不同微藻的细胞壁结构也有所差异。因此，需要加入纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等组合，综合考察不同酶组合对各种微藻的酶解效率。复合酶对两种微藻油脂提取率的影响见表4。从表4可以看出，果胶酶、蛋白酶等可以辅助破碎微拟球藻细胞壁，复合酶的使用有助于提高微拟球藻油脂的提取率，当纤维素酶、蛋白酶和果胶酶同时使用时，其油脂提取率提高到69.76%。但对小球藻来说，复合酶的使用没有促进该微藻的油脂提取，反而有所降低，说明小球藻的细胞壁结构与微拟球藻明显不同，对生物酶的敏感性差异较大，三种生物酶的加入没有产生协同作用，因此在后面的实验中处理微拟球藻将采用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的组合，而小球藻只使用纤维素酶。

表3 预处理后纤维素酶酶解微藻的油脂提取率

表4 复合酶对微藻油脂收率的影响

2.5 萃取溶剂对微藻油脂提取的影响

在微藻油脂提取的过程中，可采用有机溶剂作为萃取溶剂将微藻细胞破壁后析出的油溶性物质萃取出来。考虑到有机溶剂与水相的互溶性较差，不利于微藻油脂的析出和萃取，因此在萃取过程中加入第二极性溶剂，提高有机溶剂与水相的有效接触，从而提高微藻油脂的析出。不同有机溶剂以及有机溶剂和极性溶剂组合成双溶剂体系对微藻油脂提取率的影响见表5。从表5可以看出，加入极性溶剂甲醇或乙醇后，明显提高了两种微藻油脂的提取率，表明双溶剂体系可以协同作用，有效提取微藻中的极性及非极性油脂组份，特别是加入甲醇后，微藻油脂提取率明显提高，这是因为甲醇对于微藻的渗透性更强，更有利于微藻油脂的析出。

2.6 微藻油脂的可皂化物及不可皂化物含量的测定

微藻细胞破壁后提取油脂时，采用不同有机溶剂所得到的微藻油脂的性质也有一定差异。按照生物柴油可皂化物的测定方法可以测定所得油脂中可皂化物及不可皂化物的含量，表6中列出了分别采用正己烷-乙醇或三氯甲烷-乙醇体系萃取得到的两种微藻油脂中可皂化物及不可皂化物的含量。从表6可以看出，采用正己烷-乙醇体系萃取的微藻油脂中可皂化物含量要较三氯甲烷-乙醇体系萃取的高，这也表明采用正己烷-乙醇双溶剂体系萃取油脂有利于得到可皂化物含量更高的微藻油脂，有利于进一步合成以微藻油脂为原料的微藻生物柴油。

表5 萃取溶剂对提取微藻油脂的影响

表6 不同溶剂萃取的微藻油脂中皂化物含量

2.7 微藻油脂中脂肪酸的成分分析

微藻油脂不易被汽化，特别是所提取的微藻油脂中含有甾醇、色素以及三甘油酯等成分，因此要对微藻油脂中的多不饱和脂肪酸进行分析比较困难，通常要把所提取的微藻油脂皂化、甲酯化后再进行气相色谱分析[21]。将得到的微藻油脂分离可皂化物甲酯化后得到的脂肪酸分析结果见表7。

从表7可以看出，所提取的微藻油脂包含的脂肪酸种类较多，其主要成分是棕榈酸（C16：0）、棕榈油酸（C16：1）、十八碳烯酸（C18：1）、二十碳五烯酸（C20：5）及亚油酸（C18：2）等，特别是C20以上的长链脂肪酸，如：花生四烯酸ARA（C20：4）含量达2.8%以上，二十碳五烯酸EPA（C20：5）含量超过10%，这些物质是普通动植物油脂所不能提供的，对人体有益的脂肪酸成分，因此，微藻养殖产业对于人类营养供应乃至CO2减排都是一项前景广宽的产业。

3 结论

综合以上结果可知，碱法预处理和水酶法联合应用对于微拟球藻和小球藻细胞破壁提高油脂提取率具有显著的协同效应。采用正己烷-乙醇作为萃取溶剂替代传统使用的三氯甲烷为基础萃取溶剂，对于两种微藻油脂的提取仍然具有较好的效果，并可以萃取更多的可皂化物，有利于后续生物柴油的加工。在较低的温度下（低于100 ℃），微拟球藻的油脂提取率可达90%以上，而更难破碎的小球藻油脂也可达50%以上，实现了两种微藻的高效节能提取。对微藻油脂中多不饱和脂肪酸的分析结果表明，小球藻、微拟球藻的藻油中含有丰富的C20以上的长链脂肪酸，特别是EPA、ARA等组分含量较高，是对人体有益的营养成分，体现了微藻养殖产业的绿色、环保等社会效益和经济效益。本研究中的相关方法和结果对促进微拟球藻和小球藻油脂提取的规模化应用，具有一定的借鉴意义。

表7 微藻油脂中的脂肪酸组成（w）/%