文慧 刘珣 张尚青 杨婷 陈明丽 王建华

摘 要 检出限是判断或评价一种分析方法灵敏度的重要参数，与普通荧光探针相比，比率型荧光探针检出限的计算则比较复杂，多数情况下采用空白标准偏差的3倍与标准曲线斜率的比值作为检出限。而当比率荧光探针用于pH检测时，检出限尚无统一定义。本研究通过归纳总结发现，根据检测所得数据形式，可将比率型荧光探针分为3种，并据此设计了一种激发波长为365 nm、发射波长为600 nm/450 nm的模拟探针。通过对3种不同类型的pH比率型荧光探针检测的模拟数据进行分析，以光谱方法的检出限计算公式为原型，提出了检出限的计算公式。本方法可用于不同种类pH比率型探针方法灵敏度的比较。

关键词 比率型荧光探针; pH传感; 灵敏度; 模拟数据

1 引 言

荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、快速简便等优点，广泛应用于温度[1]、pH[2～4]、环境污染物[5，6]、重金属离子[7，8]、生物小分子[9～11]、细胞内物质[12，13]的传感分析，以及生物体[14]和细胞[15～17]成像。比率型荧光法以两个不同波长处荧光强度的比值作为响应信号，使得分析方法本身受外部环境等因素的影响大大减小。因此，比率荧光法的样品适用范围比直接荧光光谱分析法更广泛，通常具有更高的灵敏度和更好的选择性[18，19]。根据两个波长处荧光强度变化趋势的不同，可将比率型荧光探针分为四类：（1）一个波长处的荧光强度不变，另一个波长处的荧光强度变小[20，21];（2）一个波长处的荧光强度不变，另一个波长处的荧光强度变大[22];（3）一个波长处荧光强度变小，另一个波长处荧光强度变大[14，23];（4）两个波长处的荧光强度同时变大或变小[24]。

国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）1998年发表的《分析术语纲要》中规定：“检出限（LOD）以浓度或质量表示，是指由特定的分析步骤能够合理地检测出的最小分析信号x求得的最低浓度c（或质量q）”。具体到光谱分析方法，科研人员通常采用分析物产生信号为噪声信号3倍的表达方式。而pH检测与传统的检测不同，它不以某种分析物的浓度为量纲，因此，pH检测应该以最小能够响应的pH单位为检出限。检出限是判断或评价一种分析方法灵敏度的重要参数，比率型荧光探针LOD的计算则比较复杂。在已报道过的文献中，关于比率型探针LOD的计算方法有多种，比较常见的表达方式包括：空白标准偏差的3倍（3σ）[25]、标准曲线的斜率[21]、空白标准偏差的3倍（3σ）与标准曲线斜率的比值[26，27]和信噪比的3倍[8，9]等。其中，空白标准偏差的3倍与标准曲线斜率的比值是光谱分析中比较认可的检出限计算方法。而在比率荧光pH传感方法中没有空白样品，所以空白标准偏差的3倍与标准曲线斜率比值的算法无法应用，目前文献中常用的灵敏度表征参数是标准曲线斜率，即△Ratio/△pH。

灵敏度是指某方法对单位浓度或單位量待测物质变化所致的响应量变化程度，即标准曲线的斜率，因此，在多数情况下会采用标准曲线的斜率直接表征荧光探针的灵敏度，但是，仅用标准曲线斜率表征比率荧光pH传感方法的检出限难以正确评价同类方法的灵敏度，对比较不同方法间的灵敏度造成困扰。如前述荧光探针中的第（1）类，ΔRatio/ΔpH多数情况下均小于1; 而对于第（2）类，ΔRatio/ΔpH多数情况下均大于1。若仅用ΔRatio/ΔpH表征，则第（2）类方法的灵敏度多数情况下均优于第（1）类，这种结论显然不正确。由此可见，荧光探针响应信号不同，导致比率荧光ΔRatio之间相差较大，在这4种分类中，有时整个线性区间对应的ΔRatio包含1，无论是直接用ΔRatio/ΔpH，还是用1/（ΔRatio/ΔpH）表征方法检出限，均不能准确评价同类方法的灵敏度。

本研究以比率荧光法传感测定pH时常遇到的3种情况为例，基于模拟的检测结果数据，探讨了表征比率荧光法检出限的方法，提出了适用于不同情况的计算比率荧光方法检出限的方案。本方法可用于同类比率荧光pH传感方法检出限的比较，以合理评价方法灵敏度。由于在非比率荧光pH传感中也涉及无空白样品的问题，因此，本方法同样适用于非比率荧光pH传感方法检出限的计算及比较。

2 原理和方法

通常，光谱方法的检出限计算公式为：LOD=3σ/K其中，其中，σ为空白样品多次测定的标准偏差;K为标准曲线的斜率。

比率型荧光探针LOD的计算在本质上与常见的荧光探针相同。根据比率型荧光探针的变化形式，比率荧光探针可分为4类，其所获得的检测数据可归结为3种：第Ⅰ种，信号比率值Ratio>1;第Ⅱ种，信号比率值Ratio<1;第Ⅲ种，信号比率值Ratio包含1。因此，建立一种合适的检出限计算方法，即可对不同的比率荧光传感pH方法的灵敏度进行比较。

本研究假设有一种激发波长为365 nm、发射波长为600 nm/450 nm的荧光探针，其450 nm处的荧光强度保持不变。根据检测数据可能出现的形式，模拟出3种不同形式的6个比率型荧光探针的检测数据。以相关参考文献中pH探针的类型为依据，设计出各探针的检测范围及标准曲线，在标准曲线上选取合适的数据点后，再按照模拟探针本身的特点要求，通过倒推的方法获得模拟数据。对比模拟数据，探讨不同形式的比率荧光探针用于pH传感时，方法的检出限计算方案。

3 结果与讨论

3.1 比率信号值均大于1

以比率信号值均大于1的情况为例进行计算。Liu等[21]以上转换纳米粒子为核心，二氧化硅为壳层，在二氧化硅表面偶联BSA，合成了核-壳-壳结构，在壳层表面结合pH敏感型染料，即可获得比率型pH荧光探针。 本研究选用Ratio为540 nm处的荧光强度与655 nm处的荧光强度的比值（I540 nm/I655 nm），结果表明， 此探针的比率信号值均大于1。本研究以真实探针荧光光谱图的类型为基础，虚构了和它相同类型的模拟探针的荧光光谱图，如图1所示。

X模拟的探针发射波长在450 nm处的荧光强度保持不变，600 nm处的荧光强度逐渐增大，且均大于450 nm处的荧光强度，因此，比率信号值均大于1。后续其它各类型的模拟探针数据均采用此方法获得，为了保持本研究讨论的一致性，无论何种类型的荧光探针，均假定其激发波长为365 nm，发射波长为600 nm/450 nm，且450 nm处的荧光强度不变。

以Ratio（I600 nm/I450 nm）为纵坐标，pH值为横坐标，建立pH传感方法，假设有两种不同灵敏度的探针A1和A2，其在不同pH值处对应的Ratio（I600 nm/I450 nm）数据见表1（探针A1）和表2（探针A2）。两种探针对应的标准曲线如图2所示，线性方程分别为YA1=2XA1-4和YA2=XA2-1。

按照“3σ/K”的方式计算检出限时，首先遇到的问题是，对于pH传感方法，没有空白样品，无法定义空白样品多次测量的标准偏差。本研究推荐的方法为将线性范围中间值11次测量的标准偏差作为公式中的σ，探针A1和A2的标准偏差测量结果如表3所示，对应于探针A1和A2，其标准偏差分别为σA1=0.4494和σA2=0.1183。根据线性方程公式，两个pH探针对应的传感方法标准曲线的斜率分别为KA1=2和KA2=1。分别计算两种方法的检出限，即可得到LODA1=0.67， LODA2=0.35。

3.3 比率信号值包含1

相对于前文中讨论的比率信号值均大于1和均小于1的情况，比率信号值包含1的情况更为复杂。Zhang等[28]以分子内电荷转移机制和荧光共振能量转移为原理，合成了聚合物胶束比率型荧光探针，用于体内内源性次氯酸根的传感。该研究工作选用的Ratio为444 nm与551 nm处荧光强度的比值（I444 nm/I551 nm），探针的比率信号值均包含1。以Ratio（I600 nm/I450 nm）为纵坐标，pH值为横坐标，建立pH传感方法，假设有两种不同灵敏度的探针C1和C2，其在不同pH值处对应的Ratio（I600 nm/I450 nm）数据见表8和表9，标准偏差测量结果见表10。根据表8和表9数据可以得到两种探针对应的标准线性方程分别为YC1=0.5XC1-3.05和YC2=2XC2-13.6，其对应斜率分别为KC1=0.5和KC2=2（图6）。

若仅用标准曲线斜率K（ΔRatio/ΔpH）衡量方法灵敏度，第Ⅲ种探针的斜率K（ΔRatio/ΔpH）有大于1和小于1的情况，如比较K，那么C2>C1。因此，在前面讨论的基础上，可将数据进行处理， 再计算此类型探针的检出限。

本研究采用部分代表整体的方法得到与第Ⅰ种探针比较的灵敏度，即当Ratio>1的部分所占检测范围的比例超过50%时，则选用第Ⅰ种探针的计算方法，将Ratio>1的部分看作整體计算斜率，而当Ratio<1的部分所占检测范围的比例超过50%时，则选用第Ⅱ种探针的计算方法，将Ratio<1的部分看作整体计算斜率。对应第Ⅰ种探针中的A1和A2，其用于pH传感的斜率分别为KA1=2和KA2=1;对应第Ⅱ种探针中的B1和B2，经处理后，其用于pH传感的斜率分别为K′B1=2.79和K′B2=5.23; 经处理后的第Ⅲ种探针用于pH传感的斜率分别为K′C1=1.11和K′C2=2。此时，若仅比较标准曲线斜率，则对应6个pH探针的灵敏度顺序为B2>B1>A1=C2>C1>A2;若同样以线性范围中间点多次测量的标准偏差作为σ，由于计算斜率时对数据进行了处理，在计算标准偏差时应选择与斜率相同的计算方法，即当Ratio>1所占比例多时，可直接使用数据列表中的标准偏差;当Ratio<1所占比例多时，选择分别取倒数后的数值计算标准偏差，计算得到对应的检出限为LODC1=0.04、LODC2=0.12，对应6个pH探针的检出限顺序为A1>A2>C2>B2>B1>C1。

因此，对于Ratio包含1的情况，可以通过部分代表整体的方式将标准曲线斜率表达成与第Ⅰ种探针一致的形式，即使这样，单纯考虑标准曲线斜率的方法也不能全面反映方法的检出限，用综合考虑标准偏差（即方法精度）和标准曲线斜率（3σ/K）的方式可以较客观地评价方法检出限。

4 结 论

本研究针对pH比率型荧光探针检出限的计算提出了一个数学模型，此模型可以横向比较不同种类的pH比率型荧光探针。以光谱法的检出限计算公式为基础，对其中的量值进行替代， 可得到pH比率型荧光探针的检出限计算模型。空白样品的标准偏差可直接由检测范围的中间值的标准偏差替代，而标准曲线的斜率则需根据探针的类型经不同数学处理后再进行替代。根据探针的种类，标准曲线的斜率处理方式分为3种：第Ⅰ种，即Ratio>1时，标准曲线的斜率可直接替代;第Ⅱ种，即Ratio<1时，通过对检测范围两端的Ratio值取倒数后， 以两端为依据计算斜率后再替代;第Ⅲ种，即Ratio包含1时，通过部分代表整体的方法计算出斜率后再替代。通过对3种不同类型的pH比率型荧光探针模拟数据的计算讨论，表明此计算模型是合理的，适用于pH比率型荧光探针。事实上，pH值反映了溶液中H+的浓度，因此以H+浓度或最小能够响应的pH单位作为检出限的表达更为合理，本研究仅针对目前pH传感时检出限表达不一致的情况，提出了一种相对合理的统一方法，更加科学合理地表达pH检出限仍需进一步的研究讨论。

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