刘海龙 任伟成 宗利 王英武

摘 要 建立了一种利用胃蛋白酶在酸性条件下酶切，结合柱后在线还原法和液相色谱-质谱联用系统分析蛋白质二硫键的方法。在酸性体系中，采用胃蛋白酶水解蛋白质，能够最大限度地维持蛋白质二硫键的原有构象; 柱后在线还原法的应用能够弥补胃蛋白酶酶切位点专一性差、数据解析困难等不足。本研究将二者相结合并成功用于分析重组人粒细胞刺激因子（rhG-CSF）的二硫键和未配对半胱氨酸。实验结果表明，采用本方法测得经N-乙酰马来酰亚胺烷基化处理的rhG-CSF中二硫键配对方式为Cys36-Cys42和Cys64-Cys74，Cys17全部被烷基化试剂结合，且未检测到二硫键错配，实现了二硫键的完全定位。不经过烷基化处理，采用本方法测得rhG-CSF中Cys36-Cys42、Cys64-Cys74和Cys17的错配比例分别为9.1%、0%和12.6%; 基于胰凝乳蛋白酶的常规方法检测到的二硫键错配比例依次为73.4%、58.1%和97.5%; 采用Glu-C和胰蛋白酶联合酶解的常规方法检测到的错配比例依次为40.3%、5.2%和22.3%。与常规方法相比，本方法检测到的二硫键错配比例更低，测定结果能够更准确地反映二硫键在蛋白分子内的实际存在状态。

关键词 胃蛋白酶; 二硫键; 柱后在线还原法; 液相色谱-质谱联用系统; 重组人粒细胞刺激因子

1 引 言

二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰类型，在稳定蛋白质的空间结构[1，2]、维持构象及发挥生物活性等方面有着非常重要的作用[3～7]。在蛋白质药物中，二硫键构型也是一个非常关键的质量属性[8]。二硫键构型分析，有利于深入地了解蛋白质的内部结构[9，10]，对蛋白质药物的研发和质量控制具有重要意义。……