刘尚雨，郑黎晖，李波，李巨波，唐跃，姚焰

二尖瓣反流是临床常见的心脏瓣膜疾病之一，血液在心室收缩期从左心室通过二尖瓣口反流至左心房，造成左心房负荷和左心室舒张期负荷加重，引起左心房、左心室扩大，临床上出现肺淤血和体循环灌注低下等左心衰竭表现。左心室负荷增加会促进心肌纤维化，导致左心室顺应性降低而加重心力衰竭的进展和靶器官损伤[1]。硫化氢（H2S）是继一氧化氮、一氧化碳后发现的第三种内源性气体信号分子，调节机体的多种生理学功能[2-4]。在心肌缺血模型中心肌H2S 的合成体系下调，补充H2S 可保护心肌的缺血性损伤，而阻断H2S 生成会加重损伤[5-6]。压力负荷增加所致的左心功能下降是临床常见的心力衰竭类型，但因动物模型制作困难，目前对其病理生理机制研究较少。本研究旨在采用大动物水平通过小切口非体外循环下二尖瓣腱索拉伤构建小型猪二尖瓣反流慢性心力衰竭模型，检测心脏功能和结构改变，并探究H2S 体系在慢性心力衰竭中的变化，为临床对于压力负荷增加所致慢性心力衰竭病理生理机制和H2S 体系在心力衰竭中的作用提供进一步认识。

1 材料与方法

1.1 模型制备

研究选用健康8 个月龄中华小型猪，术前体重约30 kg，由中国医学科学院阜外医院实验动物中心饲养并提供，随机分为二尖瓣反流组（n=6）、对照组（n=6）。采用前期探索的小切口非体外循环下二尖瓣腱索拉伤造成二尖瓣反流建立慢性心力衰竭动物模型[7-8]。动物采用氯胺酮和地西泮诱导麻醉，气管插管，术中采用异氟醚维持麻醉。于左侧第3 或第4 肋间隙行约4 cm 平行肋间小切口，暴露心包，于左心室侧壁近心尖处缝合荷包，置入自制的“瓣膜损伤器”，回勾住二尖瓣后叶腱索并拉断，采用心表超声通过心尖二腔心切面验证二尖瓣后瓣脱垂造成中至大量反流，退出损伤器后缩窄荷包。对照组动物仅进行开胸及缝合荷包操作，不损伤二尖瓣。所有动物术后一周给予青霉素3 万单位/d 抗感染，常规饲养6 个月。

1.2 超声心动图评价

动物采用氯胺酮和地西泮诱导麻醉，气管插管，固定于检查台，超声心动图采用GE 公司的Vivid7 型彩色多普勒超声心动仪，采集左心房前后径（LAD）、左心室收缩末期容积（LVESV）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）等指标。LVEF 测定采用Simpson 双平面法。二尖瓣反流程度采用反流束面积/左心房面积比值计算，按照临床常规定义比值小于20%为轻度反流、20%～40%为中度反流、大于40%为重度反流。

1.3 在体心功能学评价

动物如1.1 所述方法麻醉，记录肢体导联心电图，穿刺右侧股动脉置入导丝，交换为8F 鞘管测量动脉压力，通过鞘管置入5F 猪尾导管至左心室测量左心室压力。心电与压力换能器与多导生理记录仪相连，稳定后连续记录至少15 min 生理参数。采用仪器分析软件分析压力参数，动脉压分析：平均动脉压、收缩压、舒张压；左心室内压分析：左心室收缩末期压力（LVSP）、左心室舒张期最低压（LVDP）、左心室舒张末期压力（LVEDP）、左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）等。实验结束后动物安乐死，提取左心室组织分别中性福尔马林固定和液氮速冻-80℃保存。

1.4 术后6 个月H2S 和N 末端B 型利钠肽原（NTproBNP）含量检测

采用化学比色法检测H2S 含量，依据文献[9]描述方法，将0.1 ml 血浆加入含有0.167%醋酸锌3.0 ml测试管中，加入0.5 ml 7.2 mol/L 盐酸配制的对苯二胺盐酸盐溶液，再加入0.4 ml 1.2 mol/L 盐酸配制的三氯化铁溶液，室温反应20 min 后加入1 ml 10%三氯乙酸，离心取上清于分光光度计检测665 nm 波长下吸光度。H2S 标准曲线采用10 mmol/L 硫氢化钠溶液梯度稀释制作。

采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测NTproBNP 含量，血清样本使用双抗夹心法NT-proBNP ELISA 检测试剂盒（R&D 公司，美国），严格按照说明书操作，酶标仪度数。

1.5 术后6 个月心脏重构和H2S 体系相关蛋白和基因表达检测

采用Western blot 法检测左心室心肌组织心脏重构相关蛋白Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ），H2S 合成体系胱硫醚-β-合成酶（CBS）；胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）蛋白含量。采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （GAPDH） 作为内部参照，采用灰度值比比较蛋白的含量差异；心肌组织经Trizol 法提取RNA，反转录为cDNA 文库。采用实时定量 PCR 法检测心脏重构相关Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及H2S 合成体系CBS、CSE mRNA 表达含量。采用GAPDH 作为内部参照，采用比值法比较基因表达的差异。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计分析软件。计量资料采用均数±标准差表示，比较采用独立样本t 检验，超声心动图指标采用配对样本t 检验。双侧P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

对照组与二尖瓣反流组超声心动图指标（表1）：两组动物均在术前和术后6 个月行超声心动图检测，二尖瓣反流组采用反流束面积/左心房面积比值评价均为二尖瓣大量反流（57.85±7.09）%。二尖瓣反流组术后6 个月LAD 与对照组比较明显扩大[（4.73±0.28）cm vs （2.67±0.12）cm，P＜0.01]，LVESV[（18.50±2.88） ml vs（10.50±0.99）ml，P ＜0.05] 和 LVEDV[（87.50±12.12） ml vs （42.33±2.04 ） ml，P＜0.01] 明 显 增 加， 但LVEF[（78.67±1.87）% vs （75.33±1.87）%，P＞0.05]和LVFS[（52.50±1.73）% vs （46.67±2.86）%，P＞0.05]无明显变化。

表1 对照组与二尖瓣反流组超声心动图指标（±s）

二尖瓣反流组与对照组术后6 个月血流动力学指标与血流动力学左心室压力-时间曲线（表2、图1）：取材前经血流动力学检测，二尖瓣反流组与对照组比较，股动脉平均压[（83.79±3.81） mmHg vs（88.40±3.48） mmHg，P＜0.01]明显降低；动脉收 缩 压[（69.84±4.41） mmHg vs （108.70±3.82）mmHg，P＜0.01]和舒张压[（54.63±2.44） mmHg vs（69.73±2.37） mmHg，P＜0.05]也明显降低；左心室功能LVSP[（86.66±5.60） mmHg vs （117.70±5.49）mmHg，P＜0.01] 明 显 降 低； LVDP[（-0.30±1.03）mmHg vs （-6.81±0.43） mmHg，P＜0.01] 明显升高；LVEDP [（12.93±2.43） mmHg vs （12.14±0.66）mmHg，P＞0.05] 两组间差异无统计学意义。左心室压力下降速率[（2 427.90±219.20） mmHg/s vs（3 562.72±233.02） mmHg/s，P＜0.01] 和 下 降 速 率[（-2 543.73±164.40） mmHg/s vs （-3 464.82±206.30）mmHg/s，P＜0.01]明显钝化。左心室压力-时间曲线可见：对照组左心室收缩期和舒张期压力变化迅速、波形锐利，收缩平台期较短且压力可维持在较高水平；二尖瓣反流组动物左心室收缩期和舒张期压力变化缓慢、波形粗顿，收缩期峰压力不能有效维持，反流造成压力波形震颤。

表2 对照组与二尖瓣反流组术后6 个月血流动力学指标比较（

表2 对照组与二尖瓣反流组术后6 个月血流动力学指标比较（

注：+dp/dtmax：左心室内压正向最大变化速率；-dp/dtmax：左心室内压负向最大变化速率。1 mmHg=0.133 kPa

平均动脉压 (mmHg) 88.40± 3.48 83.79±3.81 0.008动脉收缩压 (mmHg) 108.70±3.82 69.84±4.41 0.001动脉舒张压 (mmHg) 69.73±2.37 54.63±2.44 0.013左心室收缩末期压力(mmHg) 117.70±5.49 86.66±5.60 ＜0.001左心室舒张末期压力(mmHg) 12.14±0.66 12.93±2.43 0.762左心室舒张期最低压(mmHg) -6.81±0.43 -0.30±1.03 0.002+dp/dtmax (mmHg/s) 3 562.72±233.02 2 427.90±219.20 0.005-dp/dtmax (mmHg/s) -3 464.82±206.30 -2 543.73±164.40 0.006

图1 对照组与二尖瓣反流组术后6 个月血流动力学左心室压力-时间曲线

术后6 个月两组动物心脏形态、病理学变化：心脏取材后经心尖-二尖瓣-左心房纵向剖开大体观察，二尖瓣反流组动物二尖瓣后瓣腱索断裂，瓣叶卷曲增厚，边缘不规则增生，左心室心腔明显扩大，游离壁心肌增厚。左心室组织经5 μm 厚度石蜡切片苏木素-伊红（HE）染色显微镜观察：对照组心肌纤维排列整齐，细胞核大小形态均匀，肌束间存在少量间质；二尖瓣反流组心肌纤维排列明显紊乱，心肌细胞肥大，部分轻度空泡样变性或肌溶解，细胞核大小不等，心肌间质明显增多部分区有纤维条索，间质中有炎性细胞浸润。经马松（Masson）染色显示，二尖瓣反流组胶原等结缔组织被染成蓝色、心肌组织被染成粉红色。经显微镜观察：二尖瓣反流组心肌间质胶原明显增多，结缔组织相互连接成条索样分布，部分区域有瘢痕形成（图2）。

二尖瓣反流组与对照组术后6 个月H2S 和NTproBNP 变化（图3）:二尖瓣反流组与对照组比较，血浆H2S水平明显降低[ （27.48±2.78） μmol/L vs （37.87±3.55）μmol/L，P=0.044]，血清NT-proBNP 水平明显升高[（2 132.00±212.30）μg/L vs （456.70±40.79）μg/L，P＜0.001]。

术后6 个月两组动物心脏重构和H2S 合成体系相关蛋白和基因表达变化（图4、图5）：左心室心肌组织经Western blot 检测蛋白表达，二尖瓣反流组与对照组比较，与心肌重构相关的Collagen I（1.495±0.106 vs 1.023±0.067，P=0.003）、CollagenⅢ （1.413±0.042 vs 1.010±0.086，P=0.002 ）表 达明显上调； H2S 合成相关的酶CSE（0.750±0.030 vs 1.012±0.018，P=0.001） 与CBS（0.676±0.123 vs 0.998±0.030，P=0.029 ）表达明显下调。左心室组织制备的cDNA 文库采用Real-time PCR 法检测基因表达，二尖瓣反流组与对照组比较，心脏重构相关Collagen Ⅰ（1.658±0.134 vs 0.995±0.076，P=0.002）、Collagen Ⅲ（1.805±0.120 vs 1.037±0.090，P=0.001 ） mRNA 表达含量明显升高，H2S 合成体系CSE （0.690±0.064 vs 1.038±0.053，P＜0.001 ）、CBS（0.772±0.025 vs 1.003±0.019，P=0.002）mRNA 表达含量明显降低。

图2 术后6 个月两组动物左心室心肌病理学变化

图3 两组术后6 个月血浆H2S 与NT-proBNP 水平变化（n=6）

图4 两组术后6 个月心脏重构与H2S 合成体系蛋白变化比较（n=6）

图5 两组术后6 个月心脏重构与H2S 合成体系mRNA 表达水平比较（n=6）

3 讨论

在本研究中，使用小型猪小切口非体外循环下二尖瓣腱索拉伤造成二尖瓣反流建立慢性心力衰竭模型，通过超声心动图和在体血流动力学评价发现二尖瓣反流组动物左心室扩张、泵功能下降，病理学评价所见二尖瓣反流组动物左心室发生明显结构重构，通过分子生物学手段检测二尖瓣反流动物模型循环H2S 水平和心肌H2S 合成酶明显降低。研究提示H2S 合成体系下调可能参与二尖瓣反流所致心肌重构和心力衰竭的发展过程。

对于慢性心力衰竭的研究，多集中在冠状动脉结扎形成的缺血性心力衰竭或肾素-血管紧张素系统过度激活形成的心肌重构等模型研究[10]。对于临床中常见的压力负荷增加性慢性心力衰竭的模型复制，大动物水平能够更真实地反映心血管血流动力学变化，具有重要的价值。我们在前期大动物二尖瓣腱索拉伤模型的基础上进行改良[7-8]，采用自制的“瓣膜损伤器”，经心尖入路拉断二尖瓣后叶腱索以形成稳定的二尖瓣反流，持续6 个月后血清NT-proBNP 含量显著增高，经病理学和分子生物学评价左心室已发生明显重构，表现为心肌细胞的损伤和间质胶原的增生。本研究中二尖瓣反流组动物经心脏超声心动图检测LVEF 和LVFS 未出现明显减低，分析可能由于二维超声相关参数计算的方法学在二尖瓣大量反流干扰下会出现偏差并不能客观反映心室收缩功能[11]，经在体功能学实验证实二尖瓣反流组动物左心泵功能严重受损，提示在临床诊断中对于二尖瓣反流患者不能仅凭借超声心室收缩参数正常而轻视病情的发展。

Abe 等[12]发现，H2S 可以在哺乳动物体内内源性产生，随着研究的深入，发现H2S 可参与机体的多种生理功能的调节如：介导血管平滑肌舒张、降低血压、保护心肌缺血再灌注损伤、保护阿霉素对心肌的毒性作用、抑制炎性反应等，被视为第三种气体信号分子。H2S 可以在组织内源性生成，调控合成的酶主要为CBS、CSE 两种关键酶[4]，这两种酶的分布具有组织特异性，在心血管系统主要由CSE 发挥主要调节作用，近期发现在中枢系统存在3 -巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）也可生成H2S，但具体调控作用还有待研究[13]。H2S 通过抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡、促进血管新生等作用维持心血管系统内环境稳态[14]。在心肌缺血、血管紧张素Ⅱ介导的高血压模型中H2S 水平下调，如外源性给予H2S 供体可抑制疾病的病理生理学进展、保护靶器官的损伤[9，15]。

本研究发现，二尖瓣反流形成的慢性心力衰竭模型心肌损伤与重构，可能由于H2S 合成体系下降不能发挥相应的保护作用。有研究发现，给予H2S合成的抑制剂炔丙基甘氨酸（PPG）可观察到动脉血压升高[16]，在心肌缺血模型中阻断H2S 合成可加重心肌损伤，外源性应用硫氢化钠作为供体补充H2S可减轻心肌细胞氧化应激损伤。在由于二尖瓣反流形成的慢性心力衰竭过程中，H2S 体系的下调使心肌的自我保护功能作用下降，形成病理性损伤，导致功能学和形态学发生重构。由于H2S 的还原性可清除细胞应激所产生的活性氧和自由基[7，17]，可作为保护心肌损伤的治疗靶点。

本研究发现，二尖瓣反流慢性心力衰竭动物模型H2S 合成体系下调，可能参与心肌重构和心力衰竭的发展。由于本实验采用大型动物、模型制备困难，前期研究未设置H2S 补充治疗实验组，目前基础中最常采用的H2S 供体硫氢化钠半衰期短，毒性较大且不能口服给药，研制新型药物载体有助于将H2S 作为治疗手段应用于临床研究。