倪琦 林化

皮肤创面的血供是影响创面愈合的一个重要因素, 新生血管不仅向皮肤创面提供必要的营养物质, 同时也是创面肉芽组织的重要组成部分和创面愈合的基质。因此, 促进皮肤创面血管的再生有利于皮肤创面的修复。有研究表明, 桂林西瓜霜喷剂可以加快Ⅰ、Ⅱ期压疮创面的愈合［1］。作者前期的研究也表明桂林西瓜霜对小鼠的皮肤创面愈合有一定的促进作用, 其机制可能与其促进皮肤创面组织微血管新生有关［2］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在血管再生过程中发挥着重要的作用。本研究中, 探讨桂林西瓜霜对小鼠皮肤创面肉芽组织VEGF 表达的影响,探讨桂林西瓜霜促进小鼠皮肤创面微血管再生的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 桂林西瓜霜喷剂(桂林三金药业股份有限公司, 国药准字Z45021599), 10%水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司), Trizol提取液(美国Invitrogen公司), TaKaRa逆转录试剂盒［宝生物工程(大连)有限公司］, SYBR Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒［宝生物工程(大连)有限公司］, VEGF(小鼠)ELISA试剂盒(美国Novus公司)。低温高速离心机(Eppendorf 5804R, 德国), 实时荧光定量PCR仪(ABI7500, 美国), 酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)。

1.2 动物模型制备［2］清洁级小鼠80只(体重15~25 g), 由广西医科大学实验动物中心提供, 喂以固体平衡饲料, 自由饮水。饲养3 d后, 剃去小鼠背部区域的毛。以10%的水合氯醛(0.01 ml/g)腹腔注射麻醉后, 碘伏消毒, 运用打孔器于脊柱双侧皮肤, 制造2个直径1.2 cm的圆形全层皮肤损伤创面, 相邻创面之间至少间距1.5 cm, 然后用生理盐水润湿, 清洁创面血迹, 创面止血后使用无菌纱布覆盖, 上述处理后单笼词养。

1.3 分组与给药 将皮肤创伤模型小鼠随机分为对照组及实验组, 各40只, 各组分为造模后3、7、14及21天4个亚组(各个亚组10只)。对照组小鼠皮肤创面仅予以生理盐水清洁, 实验组小鼠皮肤创面使用生理盐水清洁后, 喷洒西瓜霜喷剂覆盖全部创面, 每日早晚各1次, 连续给药10 d。分别于造模后第3、7、14、21天, 以断颈法处死小鼠, 取皮肤创面肉芽组织检测VEGFmRNA和蛋白的表达。

1.4 实时荧光定量PCR(Quantitative Realtime PCR)检测小鼠皮肤创面肉芽组织VEGF mRNA的表达 取皮肤创面组织,用1×PBS清洗后, 按试剂说明书要求抽提总核糖核酸(RNA),测定其纯度及含量。采用20 μl反应体系, 按42℃60 min、72℃5 min反应条件逆转录合成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒说明书以cDNA作为模板进行PCR反应。VEGF引物序列：正向引物为5'-CTCGCAGTCCGAGCCGGAGA-3', 反向引物为5'-GCAGCCTGGGACCACTTGGC-3'；β-actin引物序列：正向引物5'-GGGAATGGGTCAGAAGGACT-3', 反向引物5'-CTTCTCCATGTCGTCCCA GT-3'。扩增条件：95℃预变性30 s, 95℃变性5 s, 60℃退火延伸34 s, 40个循环。运用2-△△Ct法计算基因相对表达量。

1.5 ELISA 测定皮肤创面肉芽组织匀浆VEGF蛋白的表达取50 mg创面组织, 用1×PBS清洗后剪成小块, 放入组织研磨器中, 加入0.5 ml 1×PBS, 制成匀浆, 然后置于-20℃过夜。反复冻融2次破坏细胞膜后, 将组织匀浆于4℃(5000×g)离心5 min, 取上清液待测。将100 μl待测样品与VEGF标准品分别加入包被有VEGF抗体的96孔板中, 37℃孵育1 h；加入100 μl检测溶液A, 37℃孵育1 h；加入100 μl检测溶液B, 37℃孵育1 h；然后加入底物溶液90 μl, 37℃ 避光显色20 min。当标准品孔呈现明显梯度蓝色时, 加入终止液50 μl终止反应。酶标仪450 nm波长处检测各孔光密度(OD)值,绘制标准曲线, 通过标准曲线方程计算待测样本VEGF含量。

1.6 观察指标 观察并比较两组造模后第3、7、14、21天小鼠皮肤创面肉芽组织VEGFmRNA和匀浆VEGF蛋白表达水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示, 采用t 检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组造模后第3、7、14、21天小鼠皮肤创面肉芽组织VEGFmRNA表达水平比较 造模后第3、7 天, 实验组小鼠皮肤创面肉芽组织VEGFmRNA 表达水平均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。造模后第14、21 天, 两组小鼠皮肤创面肉芽组织VEGFmRNA 表达水平比较, 差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 两组造模后第3、7、14、21天小鼠皮肤创面肉芽组织匀浆VEGF蛋白表达水平比较 造模后第3、7 天, 实验组小鼠皮肤创面肉芽组织匀浆VEGF 蛋白表达水平均明显高于对照组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。造模后第14、21 天,两组小鼠皮肤创面肉芽组织匀浆VEGF 蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 两组造模后第3、7、14、21天小鼠皮肤创面创面肉芽组织VEGF mRNA表达水平比较

表1 两组造模后第3、7、14、21天小鼠皮肤创面创面肉芽组织VEGF mRNA表达水平比较

注：与对照组比较, aP＜0.05, bP>0.05

组别 例数 第3天(n=10) 第7天(n=10) 第14 天(n=10) 第21天(n=10)对照组 40 1.98±0.23 1.99±0.20 1.36±0.23 1.16±0.28实验组 40 2.45±0.40a 2.38±0.31a 1.46±0.28b 1.21±0.26b t 6.442 6.686 1.745 0.828 P <0.05 <0.05 0.05 0.05

表2 两组小鼠皮肤创面肉芽组织匀浆VEGF蛋白表达水平比较, pg/ml)

表2 两组小鼠皮肤创面肉芽组织匀浆VEGF蛋白表达水平比较, pg/ml)

注：与对照组比较, aP＜0.05, bP>0.05

组别 例数 第3天(n=10) 第7天(n=10) 第14 天(n=10) 第21天(n=10)对照组 40 112.48±14.60 122.13±18.99 80.18±12.94 71.06±14.08实验组 40 132.89±17.94a 148.01±17.44a 85.52±13.76b 73.98±14.38b t 5.581 6.348 1.788 0.918 P <0.05 <0.05 0.05 0.05

3 讨论

创面肉芽组织的形成对于创面愈合的程度有直接的影响, 是创面修复的关键步骤, 而肉芽组织的本质是大量的毛细血管和丰富的成纤维细胞［3］。新生毛细血管网的形成具有极其重要的作用, 不仅为创面修复提供了所必需的氧及营养物质, 而且可以充实肉芽组织, 促进创面愈合［4］。VEGF 已被证实是血管发生过程中最重要调节因子, 具有促进血管生成、增加血管通透性、诱导间质胶原酶和丝氨酸的蛋白酶表达等作用［5］。皮肤内VEGF 主要分布在血管内皮细胞及成纤维细胞的胞膜和胞质中, 当机体皮肤受到损伤后局部VEGF的表达即升高［6］。既往的研究显示, 体表损伤后VEGF 的表达明显升高, 在创伤的修复过程中发挥着重要的作用［7］。

桂林西瓜霜含有西瓜霜、黄柏、锻硼砂、甘草、山豆根、黄连、青黛、黄芩等成分, 具有清热解毒、消肿止痛及一定的杀菌作用, 并兼顾滋阴、收敛、祛腐、生肌、化瘀、疏风、燥湿等功能［8-10］。作者在前期的研究中发现桂林西瓜霜喷剂对皮肤创面愈合有一定的促进作用。

本研究结果显示, 造模后第3、7 天, 实验组小鼠皮肤创面肉芽组织匀浆VEGF 蛋白表达水平均明显高于对照组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示桂林西瓜霜可以在早期通过增强创面肉芽组织中VEGF 的表达促进创面微血管生成。桂林西瓜霜促进血管生成的作用, 可改善局部创面的微循环,这一作用可能是其“活血化瘀”功效的一种表现；另一方面,新生毛细血管为肉芽组织的重要组成部分, 其生长加速可直接促进肉芽组织的新生, 此作用可能为其“生肌”作用的体现［11-13］。但桂林西瓜霜喷剂促进VEGF 表达的具体机制及通路仍需要进一步深入探讨。

目前在创面修复再生领域的研究显示, 许多治疗皮肤创面的方法包括中医外治法都显示了较好的疗效, 如回阳生肌膏、生肌象皮膏、生肌红玉膏等都具有较好的促进创面愈合的效果, 但由于现代医学方法存在价格昂贵、技术难度较高,而中药方具有方剂的配制较为复杂等缺点, 使其在临床上的使用和推广都受到了一定的限制［14-18］。

综上所述, 桂林西瓜霜喷剂使用方法简单易行, 可直接作用于患处, 具有吸收好、止痛快、疗程短、价格低廉的特点,研究为桂林西瓜霜喷剂应用于皮肤创面的临床治疗提供了一定的理论依据, 其应用前景值得期待。