莫美红 刘仔

本文对何氏养肾方颗粒进行质量标准研究, 对黄芪、生地黄进行薄层鉴定, 黄芪为君药, 具有补气健脾、升阳举陷等效果, 其有效成分为黄芪甲苷；配以生地黄有脾肾共补、摄阳归阴之效, 梓醇为生地黄的有效成分。何氏养肾方汤剂具有较好的临床治疗效果, 但汤剂在服用、携带等方面不方便。因此, 本研究采用喷雾干燥、湿法制粒等制药技术改进为颗粒制剂。为保证其治疗效果, 本研究选用HPLC 对何氏养肾方中的有效成分进行定量测定, 具有控制何氏养肾方颗粒质量的作用。

1 材料

图1 黄芪薄层色谱图

采用美国安捷伦公司1100 系列高效液相色谱仪, 色谱柱为Kromasil C18, 水纯化系统购自Millipore 公司, 电子天平材2 g, 同法制成对照溶液。薄层色谱法(中国药典2015版通则0502)试验, 吸取两种溶液各10 μl, 分别点于同一硅胶G薄层板上, 以三氯甲烷-甲醇(10∶1)为展开剂, 展开, 取出,晾干, 置氨蒸气中熏后, 置紫外光灯(365 nm)下检视。结果见图1。

2.1.2 生地黄鉴别［2］取本品5 g, 加80%甲醇50 ml, 超声处理30 min, 过滤蒸干滤液, 残渣加水5 ml溶解, 饱和正丁醇购自梅特勒-托利多公司的MS105DU 型。生地梓醇(批号110808-201210)、黄芪甲苷(批号110781-201314)对照品购自中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯, 水为超纯水,其他试剂均为分析纯。何氏养肾方颗粒自制。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

图2 生地黄薄层色谱图

2.1.1 黄芪鉴别［1］取本品5 g, 加乙醇30 ml, 加热回流20 min, 过滤滤液蒸干, 残渣加0.3%氢氧化钠溶液15 ml溶解, 滤过, 滤液用稀盐酸调节pH值5~6, 乙酸乙酯15 ml提取,分取乙酸乙酯液, 用无水硫酸钠的滤纸滤过, 滤液蒸干。残渣加乙酸乙酯1 ml溶解, 作为供试品溶液。另取黄芪对照药振摇4次, 10 ml/次, 合并正丁醇液, 蒸干, 残渣加甲醇2 ml溶解, 作为供试品溶液。另取地黄对照药材1 g, 同法制成对照药材溶液。薄层色谱法(中国药典2015版通则0502)试验, 吸取两种溶液各5 μl, 分别点于同一硅胶G薄层板上, 以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16∶0.5∶2)为展开剂, 展开, 取出,晾干, 用0.1%的2, 2-二苯基-1-苦肼基无水乙醇溶液浸板,晾干。结果见图2。

2.2 含量测定

2.2.1 黄芪甲苷 HPLC(中国药典2015版通则0512)测定。十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(32∶63)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应≥4000［3-5］。

2.2.2 生地梓醇 HPLC(中国药典2015版通则0512)测定。十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)为流动相；检测波长为210 nm。理论板数按生地梓醇峰计算应≥5000［6-8］。

2.2.3 对照品溶液制备 ①黄芪甲苷：取对照品精密称定,加甲醇制成每1 ml含0.5 mg溶液；②生地梓醇：取对照品精密称定, 加流动相制成每1 ml含10 μg的溶液。

2.2.4 供试品溶液制备 ①黄芪甲苷：精密取6.0 g, 置索氏提取器中, 加甲醇40 ml, 冷浸过夜, 再加甲醇加热回流4 h,提取液回收并浓缩至干, 残渣加水10 ml, 微热溶解, 饱和正丁醇提取4次, 40 ml/次, 合并正丁醇液, 氨试液洗涤2次,40 ml/次, 弃去氨液, 正丁醇液蒸干, 残渣加水5 ml溶解, 放冷, D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5 cm, 柱高为12 cm),水50 ml洗脱, 弃去水液, 再用40%乙醇30 ml洗脱, 弃去洗脱液, 继用70%乙醇80 ml洗脱, 收集洗脱液, 蒸干, 残渣加甲醇溶解, 转移至5 ml量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 即得。②生地梓醇：精密取1.8 g, 置具塞锥形瓶中, 加甲醇50 ml,称定重量, 加热提取1.5 h, 放冷, 再称定重量, 用甲醇补足重量, 摇匀, 滤过, 精密量取续滤液10 ml, 浓缩至近干, 残渣流动相溶解, 转移至10 ml量瓶中, 用流动相稀释至刻度, 摇匀,滤过, 取续滤液, 即得［9-11］。

2.2.5 阴性对照溶液制备 按处方比例及制法, 制成缺黄芪、生地黄的阴性对照样品；按供试品溶液的制备方法, 制成缺黄芪、生地黄的阴性对照溶液。

2.2.6 专属性试验 取混合对照品、供试品及阴性供试品进行分析。结果见图3~8。

图3 黄芪甲苷对照品色谱图

图4 黄芪供试品色谱图

图5 黄芪阴性对照品色谱图

图6 生地梓醇对照品色谱图

图7 生地梓醇供试品色谱图

图8 生地梓醇阴性对照品色谱图

2.2.7 标准曲线制备 精确取混合对照品2.5 ml, 置入5 ml容量瓶中, 加甲醇定容, 则黄芪甲苷及生地梓醇质量浓度为0.56、0.06 g/L, 在精确吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml, 置入1 ml容量瓶中加入甲醇定容, 再精确吸取试剂10 μl, 进行HPLC测定。则黄芪甲苷线性方程为Y=1.586X+1.897(r=0.9995), 质量浓度在0.1119~1.1119 g/L具有良好的线性相关；生地梓醇线性方程为Y=160947X+0.4438(r=0.9997), 质量浓度在0.0119~1.1190 g/L具有良好的线性相关。

2.2.8 精密度试验 精确取对照溶液, 均分6份, 用HPLC测定, 得黄芪甲苷、生地梓醇峰面积相对标准偏差(RSD)分别为1.9%、0.7%, 说明HPLC精密度较好。

2.2.9 稳定性试验 精确取供试品, 室温0、2、4、6、8、12 h后测定黄芪甲苷、生地梓醇RSD为0.02%、1.60%, 则常温条件12 h内较为稳定。

2.2.10 重复性试验 精确取何氏养肾方6份, 在2.2.3条件下行平行测试, 检测含量。结果表明该样品中黄芪甲苷、生地梓醇药量为1.25、0.0158 mg/L, RSD为2.3%、1.2%, 则表明HPLC具有较好的重复性。

2.2.11 加样回收率试验 精确称量1.9 g本品置于具塞锥形瓶中, 分为9份, 加入黄芪甲苷2.32 g/L溶液0.8、1.0、1.2各2份, 依据供试品溶液方法配置样品, 并按照2.2.1条件下HPLC进样10 μl, 计算加样回收率。回收率平均值为98.53%,RSD均值为2.1%。精确称量1.9 g本品置于具塞锥形瓶中,分为9份, 加入梓醇0.0304 g/L溶液0.8、1.0、1.2各2份,依据供试品溶液方法配置样品, 并按照2.2.1条件下HPLC进样10 μl, 计算加样回收率。回收率平均值为97.78%, RSD均值为2.0%。

2.2.12 样品含量测定 ①取三批次何氏养肾方颗粒样品制得供试品溶液, 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL, 注入液相色谱仪测定。结果为3次黄芪甲苷含量分别为1.2634、1.2871及1.2341 mg/g, 平均含量为1.26151 mg/g。②取三批次何氏养肾方颗粒样品制得供试品溶液, 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μl, 注入液相色谱仪测定。结果为3次生地梓醇含量分别为0.3074、0.2995及0.3036 mg/g,平均含量为0.3035 mg/g。

3 小结

本研究采用TLC 对何氏养肾方中的黄芪、生地黄等药材进行鉴定, 采用HPLC 对制剂中的黄芪甲苷、生地梓醇含量进行测定, 该方法经过多批次的检验, 结果具有较好的重复性, 则该质量标准研究方法具有可行性, 能够有效地保证何氏养肾方颗粒制剂的质量, 对临床治疗效果的保障具有重要意义［12-14］。且本研究所选取的颗粒剂型为传统制剂, 在未来的研究中可探究新剂型、新工艺的使用, 以增加何氏养肾方的生物利用度。