雷岩 方伟 张超 廖万清

(海军军医大学长征医院皮肤科，全军真菌病重点实验室，上海市医学真菌研究所，上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海 200003)

新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)是一种机会性真菌病原体，可在免疫功能低下的个体中引起致命的感染[1]。美国2018年感染性疾病学会指南指出：两性霉素B与氟胞嘧啶依旧为隐球菌感染的首选治疗药物[2]。近年来隐球菌感染率逐年上升，即使应用指南推荐药物方案治疗，死亡率仍在20%左右；临床上不正规治疗以及可用抗真菌剂数量有限等因素，也使得隐球菌耐药率问题越来越困扰着疾病治疗与预后。

在抗隐球菌以及其他致病真菌的治疗与研究中，抗真菌药物的联合使用常可以表现于广谱性能更全面、减少耐药性等积极作用[3]。此外抗真菌药物联合其他化合物时，可降低抗真菌药物剂量，从而可增加药物安全性与可耐受性[4]。故引入具有不同作用机制的新型抗真菌药物使得联合治疗成为可能的同时，更是引人注目的研究新领域。

粗糠柴苦素(Rattlerin) 是一种从粗糠柴的果实中提取的多酚类化合物，它可以诱导肿瘤细胞死亡，并可以干扰其转移与生长，已在肿瘤生物分子学领域得到广泛研究。有相关研究表明，粗糠柴苦素通过影响莽草酸激酶抑制细胞外分枝杆菌；Roshan研究发现粗糠柴苦素对于人致病酵母和丝状真菌有一定的抗真菌活性。目前尚无粗糠柴苦素联合抗真菌药物抗隐球菌体外药敏的相关报道，本研究拟通过体外棋盘法联合药敏实验，测定粗糠柴苦素联合氟康唑抗隐球菌是否有增效作用。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株 本实验共使用50株菌株，均为上海市医学真菌分子生物学重点实验室菌种库内保存，其中念珠菌标准株13株，隐球菌37株(标准株7株、临床分离株15株、环境分离株14株、野生猫科分离株1株)，相关基因类型信息详见表1，本药敏试验质控菌为近平滑念珠菌ATCC 22019。

培养基 SDA固体培养基，购自科马嘉公司；RPMI1640液体培养基(pH7.0)，购自美国Gibro公司。

药物 氟康唑(FLZ)购自美国Sigma Aldrich公司；粗糠柴苦素(Rattlerin)购自英国TOCRIS公司。

溶剂 二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)购自美国Sigma Aldrich公司；蒸馏水由日本净水机生产。

表1 本研究菌株编号以及相关信息

(续表)

1.2 方法

根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)提出的标准M27-A3以及补充方案M27-S4肉汤稀释法指南，在30℃下培养上述50株菌48h后，使用96孔板(Costar)进行体外药敏试验，后读取抗真菌活性(MIC值)[7]。其中包括体外单药药敏实验(FLZ、RAT)，应用棋盘式微量稀释法方案进行体外联合药敏实验(FLZ+RAT)，以分数抑菌浓度指数(Fractional Inhibitory Concentration Index, FICI)为判定标准，分析药物相互作用。

单药药敏试验中，氟康唑以及粗糠柴苦素MIC值读取方法与标准：在放大镜观测仪进行视觉读取，与阳性对照孔相比较，酵母类真菌生长≤50%的最低药物浓度；联合药敏试验中，MIC值读取方法与标准：在放大镜观测仪进行视觉读取，与阳性对照孔相比，酵母类真菌生长≤50%的最低药物浓度。本研究中，氟康唑与粗糠柴苦素药物浓度范围分别为64～0.5 μg/mL，256～0.25 μg/mL。

计算FICI以及效能评价标准：FICI值=(联合作用时A药MIC值/单药时A 药MIC值)+(联合作用时B药MIC值/单药时B药MIC值)。当FICI≤0.5时 判定两种药物存在协同作用；0.54.0时判定为拮抗作用。

2 结 果

检测氟康唑对13株念珠菌标准株以及37株隐球菌菌株的最低抑菌浓度范围分别为2～32 μg/mL、1～16 μg/mL(见表2)；粗糠柴苦素对白念珠菌以及隐球菌具有一定的抗真菌作用，最低抑菌浓度范围分别64～256 μg/mL、32～256 μg/mL(见表2)。应用棋盘式微量稀释法方案下，检测氟康唑与粗糠柴苦素联合作用对13株念珠菌标准株以及37株隐球菌菌株的最低抑菌浓度分别为0.5～8 μg/mL、0.5～8 μg/mL(见表2)。根据FICI计算公式以及效能判定，所有菌株FICI≤0.50，即氟康唑与粗糠柴苦素联合对所有菌株显示协同作用，其中37株隐球菌菌株FICI范围为0.07～0.50，中位数为0.312，联合使用后，氟康唑的MIC值降低了50%～93.75%(见表2)。

表2氟康唑与粗糠柴苦素联合对13株念珠菌、37株隐球菌的相互作用关系

Tab.2The effects of fluconazole and rattlerin on 13 strains ofCandidaand 37 strains ofCryptococcus

菌株单独MIC50(μg/mL)联合MIC50(μg/mL)FLZRATFLZRATFICI判定结果ATCC 2159321288320.50协同ATCC 106671612820.250.126协同ATCC 10671812810.50.129协同ATCC 140531612820.250.127协同ATCC 200264640.520.156协同ATCC2201926410.250.50协同ATCC 282264640.520.156协同ATCC 6602921280.520.156协同ATCC 90018225610.250.50协同ATCC MYA-2876812820.250.25协同CMCC(F)C1621280.580.312协同CMCC(F)C2f212810.50.50协同CMCC(F)Y10b412810.50.25协同CBS105718128240.28协同SC5314162561320.1875协同H99832220.126协同SCZ201618128280.3125协同SCZ20163161284160.375协同SCZ20164812840.250.50协同SCZ2016541280.50.250.50协同SCZ2016611280.50.250.50协同SCZ2016746420.250.50协同SCZ201681664480.375协同SCZ201694128120.266协同SCZ201701625680.250.50协同SCZ2017346420.250.50协同SCZ2017416256410.254协同SCZ20175212810.250.50协同SCZ2017612560.50.250.50协同SCZ2017712560.50.250.50协同SCZ201784640.520.156协同SCZ201791640.50.250.50协同SCZ201818256240.27协同SCZ201828640.50.250.07协同SCZ2018316128440.28协同

(续表)

注：FLZ：氟康唑；RAT：粗糠柴苦素

3 讨 论

近年来，随着HIV感染、恶性肿瘤、放疗化疗、器官或干细胞移植以及自身免疫性疾病在内的免疫功能低下人群的数量不断增加，广谱抗生素的滥用，免疫抑制剂的长期应用，以及导管介入等新型治疗操作技术的不断拓展，侵袭性真菌感染的发病率以及病死率迅速上升，其中包括隐球菌病。面对这样严峻的临床考验，现如今可供参考与普及的抗隐球菌感染药物却依旧有限，在以唑类为代表的传统抗真菌药物长期应用于临床的现状，耐药菌株的出现已成为临床治疗隐球菌病失败的最主要原因[1, 16]。中国大多数人口居住在温带和亚热带地区，这种气候本身就利于隐球菌生长与传播，且中国人口基数大，人群流动性强，势必其将对公众健康构成严重威胁。研发新型抗真菌药物、药物再利用以及天然物质中提取有效成分来协同抑菌、杀菌是未来积极应对威胁的突破口。

在本课题组前期的总结研究中，许多植物提取化合物能与现有抗真菌药物联合使用发挥协同作用，可以提高其抗真菌活性与敏感性、减少不良反应的发生。粗糠柴苦素从植物中提取[17]，安全、副作用低，最初报道为PKC及其同工酶、CAM激酶III的天然抑制剂。在前期报道中，本研究中证实粗糠柴苦素对隐球菌本身具有一定的抗真菌作用，然而其单药MIC50相对较高，同时与氟康唑联合使用能够发挥协同作用，使氟康唑的MIC值降低了50%～93.75%，提高氟康唑对隐球菌的敏感性。根据分数抑菌浓度指数效应定义，FICI数值越小，说明两种药物的协同作用越强[9, 18]，表2可以发现，新生隐球菌种属FICI范围为0.127～0.50，中位数为0.348，而格特隐球菌(Cryptococcusgattii)种属FICI范围为0.07～0.50，中位数为0.418，提示两种药物对新生隐球菌种属的协同作用较强；临床株FICI范围为0.127～0.50，中位数为0.387，而环境株FICI范围为0.25～0.50，中位数为0.351，提示两种药物对隐球菌环境株的协同作用略强于临床株。

最近研究表明粗糠柴苦素广泛抑制蛋白激酶，并且最有效地抑制PRAK和MAPKAP-K2通路，导致微管相关蛋白1轻链3β-II增强，并使S期激酶相关蛋白2表达水平下调，诱导细胞周期停滞[21-22]；通过靶向上游mTORC1控制途径来抑制细胞生长，富集细胞内自噬体，从而激活自噬，细胞膜对抗真菌药的通透性增加；mTORC1还可以导致帽依赖性蛋白质翻译的严重失调，使eIF4E和由内质网(ER)应激负调节的翻译起始因子eIF2均受到抑制。此外，粗糠柴苦素可以充当线粒体氧化磷酸化的解偶联剂，使细胞线粒体完成氧化而不能完成磷酸化，即可以利用氧而不能产生供能的ATP[24]，有可能影响到负责药物外排的蛋白质，包括 ABC(ATP-binding cassette)超家族等，减少唑类药物外排[16]。当然还需要进一步的机制实验来精确探究粗糠柴苦素抗隐球菌的机制。

综上所述，粗糠柴苦素作为多酚类热点分子化合物，对隐球菌具有一定的抗真菌活性，与氟康唑联合时，能够发挥协同杀菌作用。粗糠柴苦素来源于天然植物，具有易获取、副反应发生率低等优点，推测粗糠柴苦素具有一定的治疗隐球菌病的应用前景。