刘洁 胡小平

(北京大学深圳医院皮肤性病科，深圳 518036)

近年来，随着骨髓移植和器官移植的广泛开展、AIDS患者人数的增加、广谱抗生素的普遍应用、免疫抑制剂以及侵入性治疗的增多，侵袭性真菌感染发病率和死亡率呈现逐年上升趋势[1]，这严重危及到患者的生命健康。曲霉是引起侵袭性真菌感染的主要病原体[2]，据报道系统性曲霉感染的病死率超过50%[3]，这为临床上防治曲霉感染带来了重大挑战。缺乏特异的临床表现、诊断手段欠佳使得该类患者难以获得准确的早期诊断，此外，抗真菌药不能获得理想疗效也是一个重要原因[4]。目前临床上治疗曲霉感染的药物主要有三唑类、多烯类和棘白菌素类，这3类药物具有不同的作用机制[5](见图1)。相较于临床上多达24种的抗细菌药物和6种抗逆转录病毒药物[6]，抗真菌药因特异性细胞靶点少[5]而种类有限。随着曲霉对抗真菌药耐药报道逐年增多，而研发新药科研难度较大和经济负担较重，越来越多的研究人员着眼于联合用药防治曲霉感染。

1 现有抗曲霉感染药物

1.1 三唑类抗曲霉感染

在近十多年中，唑类药物在预防和治疗曲霉疾病方面发挥了重要作用[7]。三唑类抗真菌药最早于1980年合成，其主要包括氟康唑、伊曲康唑以及第二代抗真菌药伏立康唑和泊沙康唑等。作用机制主要是抑制羊毛甾醇转化为麦角固醇过程中重要的靶酶14α-去甲基化酶，而麦角固醇是真菌细胞膜的主要成分，其合成受阻使三唑类药物发挥抗真菌作用[8]。随后，麦角固醇的损耗以及有毒的麦角固醇前体的累积在真菌细胞膜上产生了膜应力，从而抑制其生长。唑类药物包括咪唑类和三唑类衍生物两种类型。咪唑类通常用于治疗皮肤表皮感染，而三唑类药物由于具有良好的药动学效应和安全性，通常用于治疗深部真菌系统性感染。三唑类药物是治疗侵袭性曲霉(invasive aspergillus, IA)感染的一线用药。

1.2 多烯类抗曲霉感染

多烯类是1950年发现的一种广谱天然抗真菌药，在临床上广泛用于真菌感染的治疗，常用的药物有两性霉素B和制霉菌素。多烯类药物抗真菌机制主要与真菌细胞膜上的麦角固醇相结合，干扰代谢和增加细胞膜的通透性，最终导致细胞死亡[9]。由于麦角固醇和哺乳动物的类胆固醇结构相似，多烯类药物在临床不当使用会产生严重的全身毒性和肾脏毒性。因此，在新药研发方面，目前主要集中在降低多烯类抗真菌药的毒副作用。尽管该类药物在临床上长期广泛使用，但是关于多烯类药物耐药鲜有报道[10]。

1.3 棘白菌素类抗曲霉感染

图1[5]抗真菌药结构和作用机制。A：唑类药物抗真菌作用机制主要是通过抑制羊毛甾醇转化为麦角固醇过程中重要的靶酶14α-去甲基化酶，从而导致真菌细胞膜的主要成分麦角固醇合成受阻； B：多烯类药物抗真菌机制主要与真菌细胞膜上的麦角固醇相结合，干扰代谢和增加细胞膜的通透性，最终导致了细胞死亡； C：棘白菌素类药物通过非竞争性抑制β-1,3-葡萄糖合成酶，干扰真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖的合成，导致真菌细胞壁渗透性改变，细胞溶解死亡。

Fig.1[5]The structures and mechanisms of antifungal drugs. A: Azoles disrupt ergosterol biosynthesis through inhibition of the 14-a-demethylase in the conversion of lanosterol into ergosterol； B: polyenes aremainly combined with ergosterol on the membrane, which interferes metabolism and increases the permeability of the membrane, eventually leading to cell death；C: Echinocandins inhibit the cell wall enzyme complex β-1,3-glucan synthase, disrupting cell wall integrity and resulting in fungal cell death.

棘白菌素类药物于2001年首次上市，是一类全新的抗真菌药，通过非竞争性抑制β-1,3-葡萄糖合成酶，干扰真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖的合成，导致真菌细胞壁渗透性改变，细胞溶解死亡[11]。目前使用的药物主要有卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净3种。该类药物耐受性好且几乎没有副作用，但其口服吸收效率低，特别是对隐球菌和镰刀菌几乎没有抗菌作用。临床和实验室都有报道棘白菌素耐药问题，并呈现增加趋势[12]。

2 药物联合防治真菌感染

联合应用抗真菌药物治疗曲霉感染比单一治疗有着更多优势，特别是在延迟甚至预防耐药性产生方面。联合用药后，致病真菌需要产生两种以上突变才能对其产生耐药性。很多研究表明联合用药能够逆转细菌的耐药性[13]。病原体适应环境变化产生突变时，联合用药对其突变的产生能够表现出协同效应[14]。联合用药时表现出的药物协同效应能够减少各药物的给药剂量，疗程更短，抗菌谱更广，从而有效降低毒副作用。总之，联合用药通过协同效应比单独用药具有更强的抗真菌活性和更好的临床疗效[15]。

2.1 联合用药作用机理

许多联合用药有着多重机制因而不能将其归属于单纯一种类别。两种药物的联合可能具有协同作用，目前已知有两种方式。一种表现在同一路径不同阶段的药物联合，其中一种药物在路径中的一个靶点发挥作用，另一种药物则通过作用于路径中另一个靶点来增强第一种药物的有效浓度[16]。基于这一原理，第二种药物并没有直接作用于疾病，其主要影响第一种药物的药动学参数，如增加第一种药物吸收速率和分布面积或者减少其代谢和排泄速率等。已有研究[17]通过生物利用度模型来验证此类药物相互作用，例如，Polak[18]于1978年报道的关于两性霉素B和5-氟胞嘧啶的药物联合治疗真菌感染。相似地，1997年，Yamamoto等[19]对氟康唑和氟胞嘧啶联合治疗肺隐球菌感染的探究实验也是同一种协同效应。另一方面，药物联合协同机制是两种药物在不同通路上作用于各自的靶点，总效应强于单独作用的抑菌或杀菌效果。Perea等[20]研究发现特比萘芬和唑类药物，均通过作用细胞膜上麦角固醇的合成来损伤真菌细胞的细胞膜，最终以联合用药的方式达到增强药效的目的。棘白菌素、唑类药物以及多烯类联合则是通过分别作用于真菌细胞壁和细胞膜的方式发挥作用[21]。

2.2 抗真菌药物间联合

棘白菌素类和唑类药物的联合有利于治疗曲霉感染。Marr等[22]在2015年进行了一项随机试验，将伏立康唑联合阿尼芬净和伏立康唑单独用药分别作用于IA患者，对其疗效和安全性进行评估，共有454名免疫功能缺陷患者被随机给予联合药物、单药以及安慰剂治疗，结果表明相较于伏立康唑单独用药，联合阿尼芬净后在IA患者中生存率明显增高。

棘白菌素联合多烯类药物研究方面，2007年，法国Caillot等[23]探究两性霉素B联合卡泊芬净治疗感染IA的血液系统恶性肿瘤患者时，对患者随机分组，联合治疗组给予两性霉素B(3 mg·kg-1)和标准剂量的卡泊芬净，单独用药组给予每日10 mg·kg-1的高剂量两性霉素B。最后证实两性霉素B联合卡泊芬净比单独用药有着更高的生存率。

然而，三唑类联合多烯类药物治疗真菌感染时多表现为拮抗作用。伏立康唑是目前推荐的治疗IA感染的一线用药。相较于两性霉素B，对于移植术后及白血病患者能够明显增强临床疗效及降低副反应。艾沙康唑是新一代三唑类抗真菌药，被推荐用于IA感染的治疗，并且相较于伏立康唑有更好的耐受性。2004年，Toews等[24]对21株曲霉临床分离株进行伊曲康唑联合两性霉素B试验时，发现高达33.3%的菌株在两种药物联合时表现出拮抗效应，而表现为协同效应的仅有9.5%。

2.3 抗真菌药和非抗真菌药物联合

HSP90 抑制剂 热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)最初是在1962年Ritossa研究果蝇唾液腺时发现的[25]，是一种在热应激环境下合成并被激活的一组特殊蛋白质。HSP在生物体内普遍存在且高度保守，是具有多成员的庞大的糖蛋白超基因家族。目前依据分子量大小分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP(HSP25,27,28)这5大家族。已知的HSP90抑制剂主要有格尔德霉素(geldda-namycin,GA)以及其衍生物、根赤壳菌素(radicol)、新生霉素(novobiocin)和人工合成的一些HSP90抑制剂这5类。其中根赤壳菌素是一种大环抗真菌抗生素，具有很好的抗真菌活性。在体外实验中，HSP90抑制剂和棘白菌素类联用可以解除烟曲霉对唑类和棘白菌素的耐药性[26,27,28]。研究发现，比起单独应用棘白菌素类，联用HSP90抑制剂可以提高大蜡螟在感染烟曲霉后的生存率[29]。Lamoth等[28]应用小鼠模型，采用硫胺素抑制HSP90，研究表明HSP90抑制剂能够显著减弱IA的毒力。为HSP90抑制剂与传统抗真菌药物联合增强抗烟曲霉活性提供了参考。诺华公司将研发的重组人HSP90单克隆抗体Efungumab与卡泊芬净、氟康唑以及两性霉素B联合后作用于动物模型，结果均显示出HSP90抑制剂与抗真菌药具有协同效应。但由于药品安全和生产质量问题，该公司停止了该药在人体内的实验研究[30]。

钙调磷酸酶抑制剂 钙调磷酸酶在曲霉菌致病性方面具有重要作用。Kontoyiannis[31]和Steinbach等[32]研究发现，钙调磷酸酶抑制剂增加了棘白菌素对烟曲霉的抗菌活性，并且能够将卡泊芬净的抑菌作用增强为杀菌作用。该类药物还对唑类耐药和棘白菌素耐药的烟曲霉具有强有力的抗菌活性[33]。他克莫司(Tacrolimus，FK506)可专一地结合以及抑制钙调磷酸酶，抑制T细胞中所产生钙离子依赖型信号传导通路，从而防止不连续性淋巴因子基因的转录。Gao等[34]，采用棋盘法的方法体外研究了抗真菌药物与FK506联合后，对曲霉生物膜活性的影响，结果显示他克莫司和伏立康唑或者两性霉素B联合后，对曲霉生物膜有协同抑制活性。但是，该实验也发现他克莫司与伊曲康唑或者泊沙康唑联合用药时，没有表现出显著的协同作用。在临床试验方面，2009年Mori等[35]研究伏立康唑与钙调磷酸酶抑制剂在接受异基因造血干细胞移植后的患者中的相互作用。结果表明，接受异基因造血干细胞移植后，伏立康唑对钙调磷酸酶抑制剂的血药浓度有很大的影响，但由于伏立康唑的血药浓度范围较宽，这导致钙调神经磷酸酶抑制剂联合伏立康唑使用时的剂量调整没有统一标准，而要在密切监测血药浓度的情况下实现个体化治疗。因此，研发具有抗真菌作用的特异性钙调磷酸酶抑制剂或识别特异性靶向抗真菌的钙调磷酸酶效应分子，是将来临床和实验室重点研究内容。但近年来国内外也有研究报道他克莫司与抗真菌药物合用以后， 他克莫司血药浓度受抗真菌药物影响有升高的表现，易发生不良反应[36]。目前对他克莫司与抗真菌药物合用的协同机制的研究尚处在较基础的阶段，其临床应用有待进一步的研究。

钙离子通道阻滞剂 钙离子信号通路由第二信使钙离子介导，在细胞生命活动中发挥重要作用，真菌生长发育和适应逆境也需要钙离子通路的参与。研究发现，钙离子信号通路或其关键成员参与实验室构巢曲霉和烟曲霉等对药物逆境的响应[37]。维拉帕米是钙离子拮抗剂，在临床上主要用于心血管疾病的治疗。陈培英等人[38]探究临床药物维拉帕米对伊曲康唑体外抗烟曲霉疗效，分别在含有伊曲康唑单药和两药联合的液体培养基，对烟曲霉的孢子萌发和菌丝生长情况进行形态学和镜下观察，并用微量液基稀释法和E-test法测定联合用药后伊曲康唑对烟曲霉的药物敏感性，研究认为维拉帕米增加了伊曲康唑对烟曲霉的体外抗菌能力。而Nazik等[39]研究发现维拉帕米对曲霉生物膜的抑制作用明显，但和伏立康唑联用存在拮抗效应。

其他药物 除以上类别的非抗真菌药物与抗真菌药物的联合用药，目前也有研究人员注意到在临床上用于感染性休克挽救性治疗的糖皮质激素[40]，诱导细胞膜应激和强化氟康唑抗菌活性的氯法齐明[41]，以及以桂皮醛和汉防己甲素为代表的中医中药等在抗真菌方面的联合应用。在糖皮质激素应用方面，2011年Xu等[42]研究表明地塞米松通过对Afyap1基因表达的下调，可以提高烟曲霉对过氧化氢的敏感性。相反地，2013年Li等[43]探究地塞米松对侵袭肺泡上皮细胞A549的烟曲霉的作用，在抗纤连蛋白抗体与地塞米松单独及联合作用情况下，地塞米松通过促进抗纤连蛋白表达，能增加侵袭性烟曲霉分生孢子的侵袭力。糖皮质激素对抗曲霉的作用仍待更多探究。

3 临床展望

系统性曲霉感染具有较高的致死率，而目前唑类、棘白菌素类和多烯类这三大抗真菌药物耐药现象的增多，给临床治疗带来了严峻挑战。临床上对曲霉感染的治疗方法有限，目前研究发现三大类抗真菌药物之间的联合用药，棘白菌素联合三唑类或多烯类药物可产生协同效应，多烯类联合三唑类药物多表现为拮抗作用。而非抗真菌药与抗真菌药物的联合得到了临床医生和研究人员的广泛重视和积极探索。虽然目前多数研究尚处于基础研究阶段，还需更多临床试验来进一步验证，并且在联合用药的剂量和安全性方面需要更加规范化和具体化，但是药物联合在提高临床疗效和避免曲霉耐药方面仍然有着广阔的临床应用前景。