杨启，万春，吕新远

0 引言

肝癌作为一种常见的恶性肿瘤具有恶性程度高、进展迅猛等特点，同其他恶性肿瘤一样，肝癌的发病机制十分复杂，其涉及到一系列基因、信号转导过程，这些基因的异常表达通常与肿瘤细胞周期、凋亡等生物学特性有关[1-2]。Engrailed-2（EN2）属于非Ⅰ类同源性盒基因家族成员，其具有特异性结合DNA调控基因转录的作用，目前的研究表明，EN2参与肿瘤发生，在正常细胞中高表达EN2可以促进细胞恶性增殖，缩短细胞周期[3-5]。EN2在肝癌组织中高表达，对于其在肝癌细胞凋亡中的作用尚不明确[6]。本研究拟通过敲低肝癌细胞中EN2的表达水平，明确EN2在肝癌细胞凋亡中的作用，为以后靶向EN2治疗肝癌和研究肝癌的发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HB-9018肝癌细胞HuH-7购自美国ATCC细胞库；EN2 siRNA和siRNA阴性对照慢病毒载体由广州辉骏生物科技有限公司构建；E092 SYBR Green qRT-PCR Super Mix、反转录试剂均购自德国Qiagen公司 ；ab28731EN2抗体购自美国Abcam公司；12963细胞色素C（Cytochrome C）抗体、52873激活型Caspase-9（Cleaved Caspase-9）抗体、9559第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10, PTEN）抗体、9661激活型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）抗体、12231细胞周期素B 1（Cyclin B l）抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；70-MJ101JC-1线粒体膜电位检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；BC3740胞质蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 慢病毒感染

人肝癌细胞HuH-7接种到12孔细胞板中，观察细胞融合度为60%时进行感染，添加适量的慢病毒液，使MOI=10，同时在细胞中加入polybrene（浓度为5 μg/ml），培养12 h以后，将慢病毒培养液吸弃以后，更换新鲜的培养液，在感染后72 h观察荧光表达情况，感染率高于85%时可用于后续实验。取稳定感染EN2 siRNA和siRNA阴性对照（NC）慢病毒的HuH-7细胞标记为EN2 siRNA、siRNA-NC，未感染慢病毒的细胞作为空白对照（Control）。

1.3 qRT-PCR测定干扰效果

RNA抽提：Control、EN2 siRNA、siRNA-NC细胞中添加TRIzol，静置5 min，添加1/5 TRIzol体积的氯仿，振荡混合30 s，将水相层和有机相混合以后，静置2 min分层，吸取上层水相层溶液与500 μl的异丙醇轻轻混合后，置于室温中结合10 min，此时RNA存在于底部沉淀中，用75%的乙醇将RNA洗涤，风干，溶解在DEPC水中。反转录：1.0 μg RNA85℃孵育5 min后，立即放于冰上冷却，PCR管中配制反转录体系（0.5 μl Oligo dT，0.5 μl Random primer，2.0 μl的10 mmol/L dNTP，4.0 μl 5×Buffer，0.5 μl M-MLV），30℃反应10 min，42℃反应60 min，85℃反应10 min。PCR反应：取5.0 μl cDNA，添加0.5 μl上下游引物、10 μl 2×SYBR Green qRT-PCR Super Mix、4.0 μl的dH2O，95℃变性5 min后，95℃反应15 s，60℃反应32 s，72℃反应30 s，循环40次。使用Ct值进行分析，内参为β-actin。EN2上游：5’-TCTTGGAGTGGCTGCTTCTG-3’，下游：5’-TCCTGGAGGATTCTGAGTTCTT -3’。β-actin上游：5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’，下游：5’-TCTGCGCAACTTAGGTTTTG-3’。

1.4 Western blot测定干扰效果

细胞蛋白提取：Control、EN2 siRNA、siRNA-NC细胞中添加PIRA裂解液，冰上孵育30 min，4℃，12 000 g离心10 min后，吸取上清液，用Bradford法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳：配制8%的分离胶和5%的浓缩胶，将蛋白同上样缓冲液混合煮沸5 min变性，用恒压80 V电泳约50 min以后，蛋白进入到分离胶，120 V恒压电泳2 h，关闭电泳，取出凝胶，100 V恒压转膜80 min，将NC膜在5%的牛血清白蛋白中室温孵育1 h，取出封闭后的NC膜，放在TBST中室温洗涤3次，每次5 min。同1:200稀释的EN2抗体在4℃结合过夜，TBST中洗涤3次，每次5 min。再与1:6 000稀释的HRP标记的二抗在室温结合2 h后，TBST中洗涤3次，每次5 min。ECL化学发光，使用Lab Works对电泳的条带分析灰度值，以β-actin作为参照。

1.5 细胞活力测定

细胞活力检测用MTT法，步骤为：Control、EN2 siRNA、siRNA-NC细胞配制成4×104个/毫升的细胞悬浮液，分别种植到96孔板（每孔添加100 μl），分别在各个时间点（24、48、72和96 h）将培养板从培养箱内取出，加入MTT溶液，孵育4 h，弃上清液。继续添加150 μl的DMSO，用不含细胞的孔调零，在酶标仪上读板，测定490 nm波长处的A值。

1.6 PI单染法测定细胞周期检测

Control、EN2 siRNA、siRNA-NC细胞配制成每毫升含有1×106个细胞的单细胞悬浮液，取1 ml至离心管中，2 000 g离心10 min，添加预冷后的PBS洗涤细胞3次，用预冷的75%甲醇悬浮后在4℃条件过夜，离心后，添加PI染液，4℃反应30 min，置于流式细胞仪上检测细胞周期。

1.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

Control、EN2 siRNA、siRNA-NC细胞配制成每毫升含有1×106个细胞的单细胞悬浮液，取1 ml至离心管中，2 000 g离心10 min，PBS洗涤3次，添加200 μl缓冲液，加入PI和Annexin V-FITC染液，再加入300 μl缓冲液，立即置于流式细胞仪上检测。

1.8 Western blot。方法检测细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、PTEN及Cyclin B1蛋白表达

步骤同1.4，Cleaved Caspase-3抗体稀释倍数为1:200、Cleaved Caspase-9抗体稀释倍数为1:200、PTEN抗体稀释倍数为1:400及Cyclin B1抗体稀释倍数为1:400。

1.9 线粒体膜电位及胞质中Cytochrome C蛋白检测

细胞线粒体膜电位检测用JC-1法，结果用红色荧光与绿色荧光的比值表示，具体的操作步骤同杭州联科生物技术股份有限公司70-MJ101线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）说明书，细胞胞质中Cytochrome C蛋白检测。方法用Western blot，步骤同1.4，用北京索莱宝科技有限公司BC3740胞质蛋白提取试剂盒提取胞质蛋白。

1.1 0 统计学方法

2 结果

2.1 敲低EN2后的检测结果

肝癌细胞感染EN2 siRNA慢病毒后，细胞中的EN2转录和表达水平均降低（mRNA: F=70.336,P=0.000；蛋白：F=29.404, P=0.001），见图1。表明成功构建了稳定下调EN2表达的肝癌细胞株。

2.2 细胞增殖活性检测结果

肝癌细胞经MTT检测后发现，与对照组比较，敲低EN2表达的细胞24、48、72和96 h的A值明显降低（24 h: F=8.690, P=0.017; 48 h: F=16.814,P=0.004；72 h: F=23.165, P=0.002; 96 h: F=35.707,P=0.001），细胞活力降低，见图2。表明敲低EN2降低肝癌细胞活力。

2.3 细胞周期变化检测结果

与对照组相比，敲低EN2表达的肝癌细胞G2/M期比例明显升高（G0/G1期：F=4.95, P=0.054;S期：F=0.906, P=0.453；G2/M期：F=29.301,P=0.001），细胞周期受到阻滞，见图3。

2.4 细胞凋亡检测结果

与对照组相比，敲低EN2表达的肝癌细胞凋亡率明显升高（F=221.807, P=0.000），见图4。说明敲低EN2可以诱导肝癌细胞凋亡。

2.5 细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、PTEN及Cyclin B1蛋白检测结果

与对照组相比，敲低EN2表达的肝癌细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和PTEN蛋白水平明显升高，Cyclin B1蛋白水平明显降低（Cleaved Caspase-3: F=54.177, P=0.000; Cleaved Caspase-9: F=128.368, P=0.000; PTEN: F=17.299,P=0.003; Cyclin B1: F=19.500, P=0.002），见图5。敲低EN2可以影响肝癌细胞中凋亡蛋白、周期蛋白及PTEN蛋白表达。

图1 EN2 siRNA慢病毒感染后肝癌细胞中EN2 mRNA(A)和蛋白(B~C)表达变化Figure1 EN2 mRNA(A) and protein(B-C) expression in hepatocellular carcinoma cells after EN2 siRNA lentivirus infection determined by Western blot

图3 各组肝癌细胞细胞周期分布变化Figure 3 Cell cycle distribution of liver cancer cells in each group

2.6 线粒体膜电位和胞质中Cytochrome C蛋白检测结果

敲低EN2后肝癌细胞胞质中Cytochrome C蛋白水平明显升高（F=31.371, P=0.001），线粒体膜电位明显降低（F=17.966, P=0.003），见图6。敲低EN2可以降低肝癌细胞线粒体膜电位，提高胞质中Cytochrome C蛋白水平。

3 讨论

人类的EN2基因可以编码333个氨基酸，其定位于7q36染色体上，EN2蛋白包括5个功能较为保守的亚区，按照N端到C端依次命名为EH1~EH5，EH4为同源结构区域，具有调控EN2蛋白的摄取及分泌作用，EH1、EH5能够抑制EN2蛋白的促转录作用，EH2、EH3调控EN2蛋白同DNA的亲和能力[7-9]。目前研究报道表明，EN2在胚胎发育、细胞恶性增殖等过程中具有重要作用，其表达水平的高低与肿瘤发生有关[10-11]。在人类膀胱癌中的研究表明，沉默EN2表达可以降低膀胱癌细胞的增殖能力，同样在胃癌、肾癌等肿瘤细胞中得到证实[9,12-14]。本实验结果显示，敲低EN2的肝癌细胞活力降低，细胞凋亡增多，G2/M期细胞比例升高，敲低EN2具有抑制肝癌细胞增殖的作用，EN2在肝癌中可能发挥促进作用。

图5 敲低EN2对肝癌细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、PTEN及Cyclin B1蛋白水平的影响Figure5 Effect of EN2 knockdown on Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-9, PTEN and Cyclin B1 protein levels in hepatocellular carcinoma cells detected by Western blot

细胞周期进程是细胞增殖的基础，细胞周期进程与细胞内多种蛋白的表达调控有关，其中G2期是细胞周期进程中的检查点，Cyclin B1是调控G2期的周期相关蛋白，其可以通过促进周期相关蛋白复合物的形成促使细胞完成G2/M期的转变[15-16]。EN2具有调控细胞周期的作用，沉默EN2表达可以将肾小管上皮细胞周期阻滞在G2/M期，在正常乳腺细胞中的研究也显示，高表达EN2可以缩短细胞周期，促进细胞快速增殖[17-18]。本实验的结果表明，敲低EN2后的肝癌细胞G2/M期比例升高，细胞中Cyclin B1蛋白水平降低，敲低EN2可以通过调控周期蛋白的表达阻滞肝癌细胞周期。

图4 敲低EN2后肝癌细胞凋亡的变化Figure 4 Apoptosis of hepatocellular carcinoma cells after knocking down EN2 detected by fl ow cytometry

图6 敲低EN2对肝癌细胞胞质中Cytochrome C蛋白表达和线粒体膜电位的影响Figure6 Effect of EN2 knockdown on Cytochrome C protein expression and mitochondrial membrane potential in hepatocellular carcinoma cells

肿瘤细胞恶性增殖的同时凋亡水平降低，肿瘤细胞的凋亡与细胞内的Caspase蛋白家族有关，Caspase蛋白家族是广泛存在于多种细胞中的凋亡调控因子，含有多个成员，在细胞凋亡中发挥促进作用，Caspase-3活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志，Caspase-9活化增多是Caspase凋亡反应的标志[19-20]。Caspase-9参与细胞线粒体凋亡途径，可以被胞质中的Cytochrome C激活，正常情况下的Cytochrome C多存在于线粒体中，只有受到病理或生理因素刺激以后，线粒体膜电位降低，线粒体内的Cytochrome C才可以被释放到胞质中，发挥凋亡促进的作用[21-22]。本实验的结果显示，敲低EN2表达可以促进Caspase-3和Caspase-9活化，降低线粒体膜电位，提高胞质中Cytochrome C蛋白水平，敲低EN2可以通过线粒体途径诱导肝癌细胞凋亡。

本实验还显示，敲低EN2可以提高肝癌细胞中PTEN的表达水平，从而影响肝癌细胞的生物学特性。PTEN是一种抑癌基因，具有影响肿瘤浸润、生长、骨架蛋白组装等作用，参与细胞内多种信号的转导[23]。有研究报道显示，外源性的PTEN可以诱导肿瘤细胞的凋亡并阻滞细胞周期，并且对于不同的细胞周期阻滞作用不同，PTEN诱导细胞凋亡作用机制与影响线粒体中Cytochrome C的释放有关[24-26]。本实验提示敲低EN2能够通过PTEN介导的线粒体凋亡途径诱导肝癌细胞凋亡发生，为以后研究肝癌的发病机制提供了基础，而对于其具体的作用机制尚未验证，我们将会在以后的实验中进行探讨。