胡晓红，柏华，段娟娟 ，雷秀 ，张启芳

0 引言

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其中20%~25%乳腺癌患者携带过表达表皮生长因子受体2（human epithelial growth factor receptor 2,HER2）[1-2]。 HER2过表达预示着患者易有淋巴结转移、肿瘤分化差、无疾病总体生存期短[3]。靶向HER2阳性的药物，例如人源化曲妥珠单抗和双重HER2-EGFR酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼，可使HER2阳性乳腺癌患者的临床结果得到显著改善[4-6]。但是，患者对两种药物产生耐药性是治疗HER2阳性乳腺癌面临的巨大挑战，大约50%的HER2阳性患者在治疗一年后表现出对曲妥珠单抗的抗药性[7]。拉帕替尼在接受过曲妥珠单抗治疗失败的晚期转移性HER2阳性乳腺癌中取得了较好的临床疗效， 然而，只有不到25%达到一定疗效，其中大部分最终会产生获得性耐药[8-9]。因此，这些抗性产生的机制仍然是临床上尚未解决的重要问题。

本研究中，我们用HER2阳性乳腺癌细胞株BT-474建立拉帕替尼耐药细胞株，检测拉帕替尼诱导分泌的白介素-6（Interleukin-6, IL-6） 在拉帕替尼耐药中的作用，旨在探讨靶向治疗HER2阳性乳腺癌的耐药机制，为突破耐药提供可能的新靶点和思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及处理

人乳腺癌BT-474细胞购自美国ATCC细胞库，RPMI培养基中加入10%胎牛血清（美国Gibco公司）以及1%青霉素和链霉素双抗Antibiotic-Antimycotic（美国Gibco公司），置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2 药物与试剂

拉帕替尼购自美国MedchemExpress（MCE）公司, 人源IL-6R ELISA和MTT检测试剂盒购自美国ThermoFisher Scientific公司，Caspase 3/7Glo购自美国Promega公司，RNeasy Plus kit购自德国Qiagen公司，cDNA合成试剂盒（iScript）购自美国Bio-Rad公司。P-gp、兔抗STAT3、兔抗P-STAT3，兔抗Cleaved caspase-3、兔抗TUBULIN、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、兔抗羊二抗均购自美国CST公司。

1.3 MTT检测细胞IC50

调整细胞悬液的浓度，以5×103个/孔的密度分别将细胞接种于96孔板内，每孔加200 μl完全培养基，置于细胞培养箱内培养。第二天用DMSO或拉帕替尼处理。处理48 h后，每孔细胞加入12 mmol/L MTT液10 μl，连续孵育4 h，停止培养，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，避光摇晃，酶标检测仪测定540 nm处的吸光度值。根据公式计算细胞增殖抑制率：抑制率=（1-加药组OD值/对照组OD值）×100%。

1.4 拉帕替尼耐药细胞株的建立

用0.2、0.5、1.0、2.0 μmol/L拉帕替尼逐渐递增浓度直至4.0 μmol/L处理细胞加以诱导，维持6月，建立稳定BT-474耐药株（BT-474R）。Western blot法检测耐药标志蛋白P-gp的表达。用MTT法检测BT-474R细胞的生长抑制IC50值。用Caspase-Glo®3/7法验证拉帕替尼诱导的Caspase3/7酶的活性在BT-474R细胞是否比在BT-474细胞降低。

1.5 Western blot检测蛋白表达水平

收集细胞，提取总蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白, 将蛋白转移到PVDF膜上，封闭，常规一抗和二抗孵育后, 用ECL超敏免疫印迹检测试剂（英国Amersham公司）检测蛋白表达，用Image J软件分析蛋白图像强度。

1.6 Caspase-Glo® 3/7法检测细胞凋亡

把16 000个细胞（100 μl）接种于96孔不透明白板，按实验方案加入DMSO或拉帕替尼处理6 h。不含细胞的培养基样品吸收值作为背景值。DMSO处理的细胞样品作为阴性对照。按照试剂盒说明书进行操作。用药细胞处理到达时间时，取出96孔板，平衡至室温。每孔加入100 μl Caspase-Glo®3/7试剂，混匀，室温孵育90 min。采用具备荧光检测功能的读板机读取荧光值。

1.7 细胞转染

选取对数生长期的乳腺癌BT-474细胞株，悬浮在无抗生素的培养液里，按1×106个细胞接种10 cm培养皿培养过夜。制备终浓度为50 nmol/L的siSTAT3或siScr。 用无血清OPTI-MEM分别稀释siSTAT3、siScr和Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂，室温静置5 min后混合，逐滴加入待转染的细胞中。 转染12 h后换新鲜培养基。Western blot检测基因沉默效率。Stat3 siRNA（siSTAT3）正义链为：5′-GGAAGCUGCAGAAAGAUACGACUGA 3′, 阴性siRNA (siScr) 正义链为：5′-CUGCUAUCACCGACAGCUAAGGGAC-3′。

1.8 qPCR检测IL-6 mRNA的表达

用RNeasy试剂抽提细胞总RNA，按iScript反转录试剂盒说明书合成cDNA，用Sybr Green分别进行实时荧光定量PCR反应。人IL-6引物：上游为5′-CCAGGAGCCCAGCTATGAAC-3′，下游为5′-GATGCCGTCGAGGATGTACC-3′，扩增片段长度为206 bp；β-actin内参引物为：上游引物5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游引物：5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGA GTG-3′，扩增片段长度为179 bp；人IL-6R引物：上游引物为5′-TGAGCTCAGATATCGGGCTGAAC-3′，下游引物为5′-CGTCGTGGATGACACAGTGATG-3′。

反应条件为：95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40个循环。采集待测基因和内参（β-actin） , 计算ΔΔCt及相对含量（RQ），RQ=2-ΔΔCt。

1.9 流式细胞术检测细胞凋亡

用siSTAT3或siScr转染BT-474R细胞6 h后，用DMSO或拉帕替尼处理细胞48 h，在37℃、5%CO2培养箱孵育48h，收集细胞后用Annexin V-FITC/PI双染色法凋亡试剂盒（eBioscience）检测细胞凋亡，按使用说明书操作。样品准备好后上流式细胞仪检测细胞凋亡，数据用FlowJo软件处理。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0自带统计分析软件处理数据，每组实验重复3次，实验数据以均数±标准差（±s）表示。两组之间的数据采用t检验, 多组间的单变量比较采用单因素方差分析（One way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 拉帕替尼耐药细胞株BT-474R的鉴定

Western blot结果显示，BT-474R细胞中P-gp的表达比BT-474显著增加，见图1A。用MTT法检测BT-474细胞的IC50大约是0.22 μmol/L, 而BT-474R细胞的IC50大约是2.8 μmol/L，即BT-474R细胞IC50是BT-474细胞的12.7倍，见图1B。Caspase Glo®3/7法显示BT-474R细胞中拉帕替尼诱导的Caspase3/7酶的活性比BT-474细胞显著降低，见图1C。以上结果说明BT-474R细胞具有拉帕替尼耐药性。

2.2 拉帕替尼对STAT3活性的影响

Western blot结果显示，拉帕替尼能上调p-STAT3水平，即增强STAT3活性，见图2A。在BT-474R细胞中p-STAT3的表达比BT-474细胞显著升高，见图2B。由此说明拉帕替尼增强STAT3活性。

2.3 抑制STAT3表达对Caspase 3/7活性的影响

图1 拉帕替尼耐药细胞株BT-474R的构建Figure1 Establishment of lapatinib-resistant BT-474 cell line (BT-474R)

图2 拉帕替尼诱导STAT3活性Figure2 Lapatinib treatment induced STAT3 activity

Western blot结果显示，siSTAT3有效地沉默了STAT3表达，见图3A。用DMSO或拉帕替尼处理BT-474R细胞24 h后，用Western blot检测细胞凋亡标志产物Cleaved Caspase 3的表达水平，沉默STAT3后，BT-474R细胞中拉帕替尼诱导的Cleaved Caspase 3的表达水平显著高于未沉默组（siScr），见图3B。用Caspase Glo®3/7法结果显示：沉默STAT3后，BT-474R中拉帕替尼诱导的Caspase 3/7的表达水平显著高于未沉默组（siScr），见图3C。这些结果说明BT-474R细胞对拉帕替尼的耐药性依赖STAT3活性。

2.4 沉默STAT3对拉帕替尼诱导耐药细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，拉帕替尼诱导的细胞凋亡率在STAT3沉默组为33.42%，在未沉默组（siScr）组细胞为18.52%，差异有统计学意义（P<0.01），见图4A。Western blot检测结果表明沉默STAT3后显著抑制耐药基因P-gp表达，见图4B。

2.5 拉帕替尼通过刺激乳腺癌细胞分泌IL-6对STAT3活性的影响

qPCR检测结果显示，拉帕替尼显著诱导了BT-474细胞的IL-6 mRNA 表达，见图5A。Western blot检测结果表明BT-474R细胞的IL-6蛋白表达水平显著高于BT-474细胞，见图5B。与BT-474细胞相比，qPCR检测结果显示拉帕替尼没有显著诱导BT-474R细胞中IL-6R mRNA的表达，见图5C。Western blot检测上清液中IL-6表达，BT-474+DMSO作为阴性对照，BT-474+Lapatinib作为阳性对照，结果表明BT-474R细胞分泌IL-6蛋白，见图5D。

用IgG或IL-6抗体预处理BT-474细胞，然后用拉帕替尼处理BT-474细胞后的上清液（CM）刺激BT-474细胞，Western blot检测结果显示，IL-6抗体组没有刺激STAT3活性， 这个结果说明IL-6抗体中和上清液的IL-6，导致STAT3没有被激活，见图5E。这些结果表明拉帕替尼诱导的IL-6分泌刺激STAT3活性，增强了BT-474细胞耐药性。

图3 抑制STAT3表达对拉帕替尼诱导耐药细胞裂解的Caspase 3和Caspase3/7活性的作用Figure3 STAT3 silencing enhanced lapatinib-mediated cleavage Caspase 3 and Caspase 3/7 activity

图4 STAT3表达对拉帕替尼诱导耐药乳腺癌BT-474细胞凋亡的调控Figure4 STAT3 expression mediated lapatinib-induced apoptosis of breast cancer BT-474 cells

图5 拉帕替尼通过刺激乳腺癌细胞分泌IL-6影响STAT3的活性Figure5 Lapatinib stimulated STAT3 activity via IL-6 signaling

3 讨论

拉帕替尼是靶向HER2阳性癌症的第二代靶向药物，但患者对其产生的耐药阻碍了它的疗效。研究显示拉帕替尼会激活一些信号通路，包括PI3K/AKT/mTOR、Ras/ERK和HER2通路，由此引起拉帕替尼耐药[10-11]。拉帕替尼能上调耐药蛋白P-gp的表达。虽然拉帕替尼能有效抑制HER2活性，但是最近用拉帕替尼单药治疗癌症的临床试验也宣告失败，其原因是拉帕替尼诱导HER2与HER3形成持续激活的异聚体，促进乳腺癌细胞生长[12]。在靶向EGFR、ERK治疗中，反馈信号激活促癌基因信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）是靶向耐药的主要原因[13-14]。 在EGFR突变的非小细胞肺癌细胞，酪氨酸激酶抑制剂埃洛替尼诱导持续性激活STAT3[15]。

虽然拉帕替尼自身能抑制HER2活性，但最新研究发现拉帕替尼也会促进乳腺癌细胞生长， 原因可能是拉帕替尼诱导了HER2与HER3形成持续激活的异聚体[13]。拉帕替尼耐药机制有待研究。本研究发现拉帕替尼通过诱导乳腺癌细胞表达和分泌细胞因子IL-6激活STAT3，引起细胞耐药。

我们首先建立了拉帕替尼耐药细胞株BT-474R。通过检测证实了BT-474R细胞株高表达耐药标志蛋白P-gp，IC50是BT-474的12.7倍，拉帕替尼诱导的Caspase3/7活性在BT-474R显著低于亲本细胞，说明BT-474R是耐药细胞。

因为STAT3在许多肿瘤、耐药细胞株，包括一些靶向耐药细胞中处于持续性激活状态， 促进肿瘤细胞增殖、抗凋亡、促血管生成等。在携带EGFR突变的非小细胞肺癌细胞，酪氨酸激酶抑制剂埃洛替尼诱导STAT3持续性激活[15]。因此本实验检测了拉帕替尼是否能增强STAT3的活性。结果显示，拉帕替尼可以诱导STAT3活性，在BT-474R中，我们观察到随着时间的推移拉帕替尼逐渐增加STAT3活性，表明反馈机制可能是STAT3持续激活的基础。

为了探究STAT3表达是否有助于提高拉帕替尼抗性，我们在BT-474R细胞中沉默STAT3基因，显著增加了拉帕替尼诱导的细胞凋亡标志蛋白Cleaved Caspase 3表达和Caspase3/7的活性，说明拉帕替尼耐药依赖STAT3表达，STAT3的反馈激活有助于耐药性的出现。流式细胞术检测的细胞凋亡结果也显示STAT3基因沉默增强了拉帕替尼诱导的细胞凋亡。

与我们这些结果类似，在HER2阳性乳腺癌和胃癌中，曲妥珠单抗耐药与由上游纤连蛋白/EGF /IL-6诱导的以STAT3为中心的正反馈环机制相关[14]；对非小细胞肺癌耐药机制的研究也清楚地证明，抑制各种络氨酸激酶受体，包括EGFR、丝裂原活化蛋白激酶激酶MEK、FGFR和HER2，可以触发STAT3的反馈激活[15]。

为了进一步探索STAT3反馈激活的机制, 对拉帕替尼调控的可激活STAT3的候选上游激活因子进行了理论筛选。在HER2阳性乳腺癌中，IL-6可诱导耐药的发生、促进肿瘤细胞生长及反馈激活STAT3，因此我们认为IL-6是最可能的候选因子。IL-6或其受体的表达升高常见于许多癌症类型，并且与预后不良有关[16-17]。此外，IL-6表达使肿瘤细胞对抗癌疗法具有抗性[18-19]。Hartman等报道HER2过表达增强IL-6转录，导致IL-6/JAK/STAT3自分泌环的激活，这在HER2阳性乳腺癌的发生中起关键作用[20]。因此我们检测了拉帕替尼是否能刺激IL-6的表达和分泌，结果显示拉帕替尼的确能够诱导IL-6的表达和分泌，来自拉帕替尼处理的细胞上清液可以激活BT-474细胞STAT3活性，而用IL-6抗体中和拉帕替尼诱导分泌的IL-6上清液，不能激活BT-474细胞STAT3活性，说明拉帕替尼耐药中增强的STAT3活性是通过拉帕替尼分泌的IL-6反馈机制调控的。最近一项研究成果与我们的结果一致，IL-6调控HER2阳性乳腺癌拉帕替尼耐药，他们发现IL-6通过维持HER2阳性乳腺癌干细胞引起对拉帕替尼耐药[21]。除此之外，有研究已经证实IL-6R也参与激活STAT3促进肿瘤发生发展及化疗耐受[22-23], 但我们的结果显示拉帕替尼没有显著上调BT474细胞IL-6R的表达，因此，我们认为拉帕替尼是通过诱导IL-6表达激活STAT3的活性。

综上所述，抑制IL-6/STAT3信号通路可抑制HER2阳性乳腺癌拉帕替尼耐药。鉴于STAT3是调控多个肿瘤细胞生存、增殖、抗凋亡、血管生成和耐药等信号通路的枢纽和转录因子[24]，至今没有非常有效的。方法抑制STAT3表达，研究IL-6/STAT3信号通路中可驾驭的因子，有望为HER2阳性乳腺癌拉帕替尼耐药提供新的思路和靶点。