娄 彬，王云杉,2，谷明林，王大为*

(1江苏省中医药研究院转化医学实验室，南京 210028；2中国药科大学中药学院中药制剂系&天然药物活性组分与药效国家重点实验室，南京 210009)

心血管疾病已经成为我国成年人死亡的主要原因[1]。高脂血症是诱导心血管疾病的一个重要危险因素[2]。其中，甘油三酯(TG)是血脂的重要组成部分，也是导致血脂紊乱的一个重要影响因素[3]。大规模人群的流行病学和长达30年的前瞻性临床研究发现血中富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)过高是导致心脑血管疾病的独立危险因素[4-5]。

小肠合成的乳糜微粒(CM)是TRL的主要组成成分，当食物中脂质进入小肠黏膜上皮细胞后，与分泌的载脂蛋白B48(apoB-48)在内质网结合，就形成了CM[6]。CM进一步加工成熟后分泌至淋巴液，循环入血，增加血液中循环TRL的含量。当apoB-48分泌异常时，可通过增加血液中CM和TRL的含量，诱导血脂紊乱[7]。因此调控apoB-48的表达对治疗高脂血症具有重要意义。研究发现，抑制apoB-48分泌能够降低CM形成，减少餐后TRL含量，改善血脂紊乱[8]。Federico等[9]研究发现，肿瘤坏死因子(TNF-α)可通过激活p38、ERK通路，诱导SREBP-1c在肠道细胞中的活化，增加apoB-48的分泌，而抑制p38的激活，可显著降低apoB-48的分泌和CM的含量。临床上目前还缺少通过调控apoB-48从而治疗高脂血症的降脂药物。

首乌降脂汤的组方为临床经验方，作为医院制剂投入临床使用，并对高脂血症具有较好的治疗效果[10]，课题组前期预实验结果显示首乌降脂汤可显著降低肠细胞TNF-α mRNA的表达水平，并对apoB-48表达有显著的抑制作用。然而首乌降脂汤是否通过抑制炎症因子TNF-α的分泌，而减少apoB-48的分泌，改善高脂饮食诱导高脂血症的效果和机制还不明确。

因此，本实验使用高脂饮食诱导的金黄地鼠高脂血症模型，通过检测血脂指标评价首乌降脂汤的降脂药效；通过检测TNF-α的含量和丝裂原活化激酶(MAPK)通路相关通路蛋白、脂质代谢调节蛋白SREBP及apoB-48的表达变化，探讨首乌降脂汤的降脂机制，为首乌降脂汤的临床应用提供理论依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

非诺贝特片(法国利博福尼制药公司，商品名力平之)；金黄地鼠apoB-48 ELISA检测试剂盒、金黄地鼠TNF-α ELISA检测试剂盒、金黄地鼠游离脂肪酸(FFA)检测试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司)；甘油三酯(TG)测定试剂盒、总胆固醇(TC)测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；p-ERK、p-p38、p-JNK和TNF-α抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；GAPDH抗体(英国Abcam公司)。

1.2 仪 器

全波长多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)；超速控温离心机(美国Beckman Coulter公司)；电子天平(美国 Mettler Tolerdo公司)。

1.3 动 物

SPF级叙利亚金黄地鼠，雌性，100～120 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2017-0005。喂养于江苏省中西医结合医院动物中心。饲养条件：动物处于温度24～26 ℃，相对湿度40%～60%环境中，12 h光照和12 h黑暗交替，自由进食和饮水。

1.4 动物饲料

TP24200高脂饲料(含有10%脂肪、0.8%胆固醇、3%蛋黄和86.8%基础饲料)和LAD1002标准饲料喂养动物。饲料均购买于南通特罗菲饲料科技有限公司。

1.5 药物的配制

以首乌降脂汤配方为基础，取制首乌20 g，淫羊藿20 g，生山楂16 g，牛膝16 g。地黄20 g，药物加入10倍水浸泡30 min后，煎煮45 min，滤出水提液后再加入10倍水煎煮45 min。合并提取液，浓缩至相对密度1.2～1.3(50～60 ℃)，4 ℃保存。以人给药剂量按体表面积折算后给予金黄地鼠的剂量为3.33 g/kg，折算所得浸膏给药量为2.91 g/kg。非诺贝特按体表面积折算后给与金黄地鼠的剂量为10 mg/kg。药物用生理盐水配制成混悬液，4 ℃保存备用。

2 方 法

2.1 动物模型建立、分组与给药

适应性喂养1周后，金黄地鼠按体重随机分为4组：空白对照组、高脂模型组、非诺贝特治疗组[10 mg/(kg·d)]和首乌降脂汤治疗组[2.91 g/(kg·d)]，每组5只。空白对照组给予普通饲料，高脂模型组和治疗组均给予高脂饲料。高脂喂养4周后连续经口给药治疗4周，空白组和高脂模型组给予同体积生理盐水，给药期间高脂模型组和治疗组继续高脂饲料喂养。

2.2 实验指标检测

2.2.1 摄食量、体重记录 每天记录每只金黄地鼠的摄食量，每周记录动物体重。

2.2.2 生物样品取材以及生化指标测定

造模4周后，禁食12 h，水自由获取。给药结束后，禁食12 h，不禁水，腹主动脉取血，血清获取和处理方法如娄东晓等[11]所述，即3 000 r/min离心15 min，获得血清。快速剥离小肠组织，并采用生理盐水清洗，置于-80 ℃保存。按照试剂盒说明测定TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT等指标的含量。

2.2.3 酶联免疫法检测指标 采用ELISA试剂盒检测载血清中脂蛋白B-48(apoB-48)、游离脂肪酸(FFA)、TNF-α含量。

2.2.4 小肠组织取材以及Western blot测定 称取小肠组织0.1 g，用组织匀浆机研磨匀浆，4 ℃离心后取组织上清液，蛋白裂解液提取蛋白，BSA蛋白定量法测定总蛋白。采用SDS-PAGE电泳后转膜。完成后膜用5% BSA封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜。TBST清洗3次，每次5 min。二抗孵育1 h，TBST清洗3次，每次5 min。加入碱性磷酸脂酶显色试剂避光显色3 min。结合所得条带分析apoB-48、ERK、p38、SREBP等蛋白的表达情况。

2.3 数据处理与指标分析

3 结 果

3.1 首乌降脂汤对高血脂模型金黄地鼠的进食量和体重的影响

实验结果发现，高脂饮食诱导组与空白组相比，体重在高脂喂养2周后增加，有显著性差异(P<0.01)；非诺贝特和首乌降脂汤治疗组在治疗3周后均能显著抑制高脂饮食诱导的体重增加(P<0.01)(图1-B、1-D、1-E)。

各组每只鼠每天摄食量无显著性差异，说明各组之间体重差异与摄食量不同无关(图1-C)。综上，高脂饲料喂养可显著增加金黄地鼠的体重，而非诺贝特和首乌降脂片治疗都可以显著改善体重的增加，这一变化与动物摄食量无关。

3.2 首乌降脂汤对高脂饮食诱导的肥胖金黄地鼠血脂指标的影响

为了探究首乌降脂汤对金黄地鼠高脂血症模型的治疗效果，本研究检测各组血清中的血脂相关指标并进行对比。结果显示，阳性药非诺贝特治疗组和首乌降脂汤治疗组与高脂组相比，TC有一定下降的趋势，但无显著性差异(图2-A)。TG(P<0.01)、LDL-C(P<0.05)与模型组相比显著下降(图2-B、2-D)。与高脂模型组相比，非诺贝特和首乌降脂汤治疗组HDL-C显著升高(P<0.01)(图2-C)。非诺贝特治疗组AST、ALT与模型组相比均无显著变化，首乌降脂汤治疗组AST、ALT显著降低(P<0.01)(图2-E、2-F )。综上，首乌降脂汤治疗能够显著改善高脂饲料诱导的TG升高，HDL-C降低。并且对高脂饲料造成的肝脏损伤具有一定的修复作用。

3.3 首乌降脂汤对高脂饮食诱导的肥胖金黄地鼠血清中TNF-α、FFA、apoB-48的影响

为了探究首乌降脂汤的降脂机制，本研究测定高脂饮食诱导的金黄地鼠血清中FFA、TNF-α以及apoB-48的含量。结果(图3)显示，非诺贝特治疗组(P<0.05)和首乌降脂汤治疗组(P<0.01)均能显著降低高脂饮食诱导的血清FFA含量增加。而非诺贝特治疗对高脂饲料诱导的TNF-α和apoB-48显著升高具有一定的降低趋势，但不具有显著性差异。首乌降脂汤则可以显著降低血清TNF-α和apoB-48含量(P<0.01)。上述实验结果说明首乌降脂汤可通过降低炎症因子TNF-α，下调apoB-48和FFA的表达。

Figure 1 Effect of Shouwu Jiangzhi (SWJZ) on body weight and food intake of high fat diet (HFD) reduced hamsters

A:Flow design of the experiment;B:Posture of Hamsters from different groups;C-D:Food intake and body weight of hamsters from different groups;E:Increase of body weight of the different groups

CONT：Control group;HFD:Model group(High fat diet);Feno:Fenobrate;SWJZ:Shouwu Jiangzhi decoction

##P<0.01vsCONT group;*P<0 .05,**P<0.01vsHFD group

Figure 2 Effects of SWJZ on serum biochemical index of HFD-induced hamsters

A-F:Levels of TC,TG,HDL-C,LDL-C,AST and ALT in the serum of HFD-induced hamsters(TC：Total cholesterol；TG：Triglyceride；HDL-C：High density liptein cholesterol；LDL-C：Low density liptein cholesterol；AST：Aspartate aminotransferase;ALT:Alanine aminotransferase)

##P<0.01vsCONT group;*P<0 .05,**P<0.01vsHFD group

Figure 3 Effects of SWJZ on serum apoB-48,free fatly acid (FFA) and TNF-α

A -C:Level of FFA,apoB-48 and TNF-α in the serum of HFD-induced hamsters

##P<0.01vsCONT group;*P<0 .05,**P<0.01vsHFD group

3.4 首乌降脂汤可通过MAPK通路降低肥胖金黄地鼠的apoB-48

为了进一步探究首乌降脂片降低apoB-48表达的确切药理机制，本研究采用Western blot方法检测了MAPK通路相关蛋白(p38、ERK、JNK)磷酸化水平与脂质调节相关蛋白SREBP及其下游蛋白apoB-48的表达情况。结果(图4)显示，与正常组相比，高脂模型组的apoB-48、p-p38、p-ERK、JNK和SREBP均升高，而首乌降脂汤治疗后，这些蛋白的表达降低。以上结果显示首乌降脂汤可能是通过TNF-α/MAPK通路下调apoB-48表达，减少小肠CM的产生。首乌降脂汤通过apoB-48调控金黄地鼠小肠脂质代谢的可能机制如图5所示。

Figure 4 Effects of SWJZ on the protein expression in small intestine of HFD-induced hamsters

Figure 5 Diagram of the mechanism of SWJZ treatment on HFD-induced hamsters

4 讨 论

本研究探究了首乌降脂汤是否通过抑制TNF-α/MAPK通路，下调apoB-48的表达，改善高脂血症的问题。实验结果显示，首乌降脂汤能够显著降低金黄地鼠血清中TNF-α、apoB-48和FFA的含量，表明首乌降脂汤能够通过抑制TNF-α的表达从而降低血清apoB-48的含量；首乌降脂汤还能够抑制小肠组织中MAPK通路相关蛋白(p38、ERK、JNK)的磷酸化，下调SREBP的蛋白表达，减少小肠中apoB-48的含量。上述结果显示，首乌降脂汤的降脂机制可能与抑制TNF-α/MAPK通路，减少apoB-48的表达有关。有趣的是，实验结果显示，首乌降脂汤治疗组的肝脏指标(ALT、AST)明显优于非诺贝特治疗组和高脂模型组，提示首乌降脂汤在降脂的同时能够改善高脂饲料引起的肝功能损伤。

TNF-α是一种脂质稳态调节因子，可上调ERK/TNF-α炎症通路可诱导固醇元件调节蛋白-1c(SREBP-1c)在肠细胞中的活化[12]。这提示SREBP可能是MAPK脂质调控通路的下游蛋白。同时，SREBP对apoB-48亦有一定的调节作用[11]。本次实验中，首乌降脂汤对金黄地鼠的TNF-α、MAPK通路相关蛋白、SREBP以及apoB-48均有降低作用，因此，推测其能够通过抑制TNF-α/MAPK通路下调SREBP的表达，减少血液和小肠组织中apoB-48含量，从而达到治疗高脂血症的效果。

目前apoB-48作为降脂治疗的新靶点，已有研究发现apoB-48的单克隆抗体可显著抑制apoB-48的活性，发挥降脂作用[13]。但由于单克隆抗体价格昂贵、患者依从性差等特点，限制了其临床应用。首乌降脂汤不仅克服了单抗费用高的缺点，同时，首乌降脂汤中所用到的药材经现代药理学研究证明都具有较好的降脂或预防心血管疾病的活性[14-19]，证明了首乌降脂汤配伍和用药的科学性和合理性，体现出较好的临床应用前景。

本研究采用降脂效果确切的首乌降脂汤，创新性地提出通过抑制apoB-48(小肠吸收脂质必需的载脂蛋白)的分泌，进而降低血中TRL含量，发挥降脂作用的新思路。研究中将apoB-48与TNF-α和MAPK通路联系起来，探索首乌降脂汤的降脂机制，为以后降脂药物的研发奠定理论基础。但本次研究缺乏对首乌降脂片物质基础的研究；同时机制研究表浅，可在后续研究中进一步补充，如加入MAPK通路抑制剂或在基因敲除小鼠水平上进行反向验证，以及临床研究的深入验证。