张会丽，卢光莉，黄文龙，胡国强**

(1郑州工业应用技术学院药学院,郑州 451150；2河南大学商学院,开封 475001；3中国药科大学新药研究中心,南京 210009)

氟喹诺酮药物通过抑制细菌DNA回旋酶(DNA gyrase)和Ⅳ类拓扑异构酶(DNA Topoisomerase Ⅳ，Topo Ⅳ)而发挥抗菌活性，其中，DNA拓扑异构酶也是广泛存在于真核细胞核中的基本酶，二者具有同源和功能相似性，对DNA的转录、复制以及基因表达过程中的DNA拓扑结构的改变起着重要的作用[1]。同时，DNA拓扑异构酶在肿瘤组织中高度表达与肿瘤的发生、发展密切相关，抑制拓扑异构酶的活性就能阻止肿瘤细胞的快速增殖[2]。因此，基于机制的理性药物设计策略，通过氟喹诺酮结构修饰可将其抗菌活性转化为抗肿瘤活性，进而促进抗肿瘤氟喹诺酮先导物的发现[3]。与此同时，氟喹诺酮的构效关系表明，喹啉-4-酮-3-羧酸这一基团为其抗菌活性药效骨架，而C-3羧基用唑稠杂环[4]或酰胺基[5]等生物等排体替代，并引入具有广泛药理活性的α，β-不饱和酮[6]片段作为其功能修饰基可显著提高抗肿瘤活性，提示C-3羧基并非是抗肿瘤活性所必需的药效团，喹啉-4-酮骨架可能是需保留的抗肿瘤药效骨架，而α，β-不饱和酮作为C-3等排体的功能修饰基在抗肿瘤活性中所发挥的重要作用值得进一步探究。为此，选择α，β-不饱和酮药效团作为C-3羧基的等排体而非修饰基、用含有理化性质各异的N、O、S供电子原子的噻唑酮绕丹宁[7]为其稠合修饰基进而构建α，β-不饱和噻唑酮骨架，并与喹啉-4-酮骨架相拼合，设计合成了氟喹诺酮-3-甲叉基绕丹宁类目标化合物(6a～6l)，并通过体外抗细胞增殖活性筛选结果评价α，β-不饱和酮作为C-3羧基的生物电子等排体、绕丹宁为其稠合修饰基的可行性，为抗肿瘤氟喹诺酮分子的构建提供新途径。

1 合成路线

目标化合物(6a～6l)的合成见路线1。培氟沙星(1)与水合肼发生肼解反应得到培氟沙星酰肼(2)、在稀氨水介质中用铁氰化钾氧化脱肼基反应得到培氟沙星-3-甲醛(3)。另外，胺类化合物(4a～4l)与双(羧甲基)三硫代碳酸酯发生缩合反应生成N-取代绕丹宁(5a～5l)，再与氟喹诺酮-3-甲醛(3)进行Claisen-Schmidt缩合反应形成氟喹诺酮-3-甲叉基噻唑酮目标化合物(6a～6l)。

Scheme1 Synthetic route of the title compounds6a-6lR:C6H5(a);4-CH3-C6H4(b);4-CH3O-C6H4(c);4-F-C6H4(d);4-Cl-C6H4(e);4-Br-C6H4(f);3-F3C-C6H4(g);H(h);amino(i);c-Pr(j);HO2CCH2(k);benzyl(l)

2 实验部分

2.1 材 料

WK-1B数字熔点仪(上海申光仪器有限公司)；AM-400型核磁共振仪(德国Bruker公司)；Esquire LC型质谱仪(德国Bruker公司)；PE2400-Ⅱ元素分析仪(美国PE公司)。培氟沙星酰肼2[8]和绕丹宁类5[9]分别按文献的方法制备，其他试剂均为市售分析纯。实验用肿瘤细胞株购于中科院上海细胞生物研究所；非洲绿猴肾细胞Vero购买于上海通派生物科技有限公司。

2.2 化学合成

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-喹啉-4-(1H)-酮-3-甲醛(3)的合成

铁氰化钾48.0 g(146.0 mmol)溶于蒸馏水150 mL中，加入浓氨水40 mL和氯仿250 mL，常温搅拌下慢慢加入化合物2(15 g，43.0 mmol)约1 h。常温搅拌反应至原料消失(TLC)，抽滤。分出有机相，用水洗涤3次，无水Na2SO4干燥。过滤，常压回收氯仿，残余物用无水乙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶剂100 mL溶解，加入适量活性炭回流脱色0.5 h。过滤，静置2 d，析出淡黄色结晶3，收率41.6%，mp:235～237 ℃(229～233 ℃[10]);1H NMR(400 MHz,CDCl3-d6)δ:10.84(1H,s,3-CHO),8.82(1H,s,2-H),7.84(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.36(1H,d,J=8.0 Hz,8-H),4.46(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.46～3.28(4H,m,piperazine-H),2.48～2.66(4H,m,piperazine-H),2.38(3H,s,N-CH3),1.47(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:318[M+H]+。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-取代-绕丹宁-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6a～6l)合成通法

氟喹诺酮-3-甲醛(3,1.0 g，3.2 mmol)与新熔融的无水乙酸钠(0.52 g,6.4 mmol)和绕丹宁5a～5l(3.2 mmol)依次加入到冰醋酸(15 mL)中，混合反应物油浴磁力搅拌回流反应6 h。减压蒸除溶剂，残余物加去离子水50 mL溶解，用适量活性炭脱色。滤液用浓氨水调pH 8.0，二氯甲烷提取(30 mL×3)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。粗品用无水乙醇-DMF重结晶，得金黄色粉末目标物6a～6l。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-苯基-绕丹宁-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6a) 收率64.4%，mp:255～257 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:7.85(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.75(1H,s,2-H),7.51～7.26(6H,m,Ph-H and 3-CH==),6.66(1H,d,J=8.0 Hz,8-H),4.20(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.27(4H,br,piperazine-H),2.65(4H,br,piperazine-H),2.40(3H,s,N-CH3),1.58(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:509[M+H]+;Anal.Calcd.for C26H25FN4O2S2:C 61.40%;H 4.95;N 11.01;Found:C 61.63%;H 4.76;N 11.24。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(4-甲基苯基)-绕丹宁-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6b) 收率57.0%，mp:254～256 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:8.68(1H,s,2-H),7.82(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.54(1H,s,3-CH==),7.34～7.05(5H,m,Ph-H and 8-H),4.40(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.28(4H,br,piperazine-H),2.50(4H,m,piperazine-H),2.38(3H,s,N-CH3),2.25(3H,s,Ph-CH3),1.42(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:523[M+H]+;Anal.Calcd.for C27H27FN4O2S2:C 62.05%;H 5.21;N 10.72;Found:C 62.31%;H 5.38;N 10.95。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(4-甲氧基苯基)-绕丹宁-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6c) 收率53.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:7.98～7.77(2H,m,2-H and 5-H),7.54(1H,s,3-CH==),7.27～6.70(5H,m,Ph-H and 8-H),4.22(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.85(3H,s,OCH3),3.30(4H,m,piperazine-H),2.67(4H,m,piperazine-H),2.41(3H,s,N-CH3),1.59(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:539[M+H]+;Anal.Calcd.for C27H27FN4O3S2:C 60.20%;H 5.05;N 10.40;Found:C 60.44%;H 5.18;N 10.67。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(4-氟苯基)-绕丹宁-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6d) 收率51.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:8.70(1H,s,2-H),7.81(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.53(1H,s,3-CH==),7.43～7.05(5H,m,Ph-H and 8-H),4.40(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.27(4H,br,piperazine-H),2.51(4H,m,piperazine-H),2.26(3H,s,N-CH3),1.42(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:527[M+H]+;Anal.Calcd.for C26H24F2N4O2S2:C 59.30%;H 4.59;N 10.64;Found:C 59.55%;H 4.38;N 10.85。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(4-氯苯基)-绕丹宁-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6e) 收率54.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:7.94～7.72(2H,m,2-H and 5-H),7.46(1H,s,3-CH==),7.43～6.65(5H,m,Ph-H and 8-H),4.17(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.27(4H,br,piperazine-H),2.67(4H,m,piperazine-H),2.39(3H,s,N-CH3),1.52(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:543[M+H]+(35Cl);Anal.Calcd.for C26H24ClFN4O2S2:C 57.50%;H 4.45;N 10.32;Found:C 57.73%;H 4.32;N 10.57。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(4-溴苯基)-绕丹宁-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6f) 收率48.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:8.75(1H,s,2-H),7.80(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.75(2H,d,J=9.0 Hz,Ph-H),7.56(1H,s,3-CH==),7.37～7.17(3H,m,Ph-H and 8-H),4.44(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.84～3.52(4H,m,piperazine-H),3.52～3.32(4H,m,piperazine-H),2.36(3H,s,N-CH3),1.43(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:587 and 589[M+H]+(79Br and81Br);Anal.Calcd.for C26H24BrFN4O2S2:C 53.15%;H 4.12;N 9.54;Found:C 53.36%;H 3.90;N 9.76。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[3-(3-三氟甲基苯基)-绕丹宁-5-叉甲基]-喹啉-4-(1H)-酮(6g) 收率42.0%，mp:252～254 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:8.71(1H,s,2-H),7.90～7.74(5H,m,Ph-H and 5-H),7.55(1H,s,3-CH==),7.07(1H,br,8-H),4.39(2H,br,CH2),3.34～3.29(4H,m,piperazine-H),2.62～2.53(4H,m,piperazine-H),2.29(3H,s,N-CH3),1.42(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:577[M+H]+;Anal.Calcd.for C27H24F4N4O2S2:C 56.24%;H 4.20;N 9.72;Found:C 56.47%;H 4.38;N 9.95。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(绕丹宁-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6h) 收率42.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.63(1H,s,2-H),7.85(1H,d,J=13.0Hz,5-H),7.40(1H,s,3-CH==),7.16(1H,d,J=8.0Hz,8-H),4.40(2H,br,CH2),3.34(4H,br,piperazine-H),2.53(4H,br,piperazine-H),2.35(3H,s,N-CH3),1.41(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:433[M+H]+;Anal.Calcd.for C20H21FN4O2S2:C 55.54%;H 4.89;N 12.95;Found:C 55.76%;H 4.76;N 13.16。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-氨基-绕丹宁-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6i) 收率54.0%，mp:244～246 ℃；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.68(1H,s,2-H),7.80(1H,d,J=13.0Hz,5-H),7.57(1H,s,3-CH==),7.05(1H,d,J=8.0 Hz,8-H),5.92(2H,s,NH2),4.38(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.27(4H,br,piperazine-H),2.51(4H,br,piperazine-H),2.25(3H,s,N-CH3),1.42(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:448[M+H]+;Anal.Calcd.for C20H22FN5O2S2:C 53.67%;H 4.95;N 15.65;Found:C 53.9276%;H 4.77;N 15.87。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-环丙基-绕丹宁-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6j) 收率46.0%，mp:252～254 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:8.70(1H,s,2-H),7.95(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.46(1H,s,3-CH==),6.95(1H,d,J=8.0 Hz,8-H),4.22(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.29(4H,m,piperazine-H),2.88(1H,m,c-Pr-H),2.66(4H,br,piperazine-H),2.40(3H,s,N-CH3),1.57(3H,t,J=8.0 Hz,CH3),1.17～1.06(4H,m,c-Pr-H);MSm/z:473[M+H]+;Anal.Calcd.for C23H25FN4O2S2:C 58.45%;H 5.33;N 11.85;Found:C 58.67;H 5.14;N 12.06。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-羧甲基-绕丹宁-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6k) 收率46.0%，mp>260 ℃；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.66(1H,s,2-H),7.81(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.52(1H,s,3-CH==),7.05(1H,d,J=8.0 Hz,8-H),4.66(2H,s,CH2),4.38(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.30(4H,m,piperazine-H),2.66(4H,br,piperazine-H),2.36(3H,s,N-CH3),1.42(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:491[M+H]+;Anal.Calcd.for C22H23FN4O2S2:C 53.86%;H 4.73;N 11.42;Found:C 54.08;H 4.56;N 11.65。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(3-苄基-绕丹宁-5-叉甲基)-喹啉-4-(1H)-酮(6l) 收率52.0%，mp:225～227 ℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3-d3)δ:7.90(1H,d,J=13.0 Hz,5-H),7.61(1H,s,2-H),7.43(1H,s,3-CH==),7.38～6.64(6H,m,Ph-H and 8-H),5.23(2H,s,CH2),4.12(2H,q,J=8.0 Hz,CH2),3.26(4H,br,piperazine-H),2.72(4H,br,piperazine-H),2.37(3H,s,N-CH3),1.48(3H,t,J=8.0 Hz,CH3);MSm/z:523[M+H]+;Anal.Calcd.for C27H27FN4O2S2:C 62.05%;H 5.21;N 10.72;Found:C 62.31;H 5.03;N 10.96。

2.3 体外抗细胞增殖活性

对合成的12个目标化合物6a～6l、对照蒽醌类抗肿瘤药阿霉素(DOX)及母体培氟沙星(1)用DMSO配成1.0×10-2mol/L浓度的储备液，用RPMI 1640培养液稀释至所需浓度(0.1、1.0、5.0、10.0、50.0 nmol/L)即为供试液。取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(Hep-3B)、人白血病细胞(HL60)和非洲绿猴肾细胞细胞(Vero)株，分别以每孔6 000个细胞接种于96孔板，培养隔夜后，分别加入上述供试液。继续培养48 h后弃去培养基。每孔加入1 g/L MTT溶液100 μL,继续培养4 h后弃上清液。每孔加入二甲基亚砜150 μL,轻轻振荡30 min,用酶标仪在570 nm波长处测其吸收度。计算各组对实验细胞的抑制率：抑制率(%)=(1-实验组吸收度/对照组吸收度)×100。然后以各药物浓度的负对数值对各浓度下的抑制率作线性回归，得浓度-效应方程，以此计算出各供试化合物对实验细胞的半数抑制浓度(IC50)。所有实验在相同条件下重复进行3次，结果见表1。

Table 1 Anti-proliferative activity of the title compounds 6a- 6l against the tested cells

Compd.ArIC50/(μmol/L)A549Hep-3BHL60Vero6aC6H510.6±1.225.7±1.828.6±2.057.6±2.46b4-CH3-C6H417.6±1.527.6±1.430.6±2.363.2±1.86c4-CH3O-C6H418.3±1.432.6±2.335.0±2.761.5±2.46d4-F-C6H44.7±0.58.6±1.07.8±1.053.6±2.86e4-Cl-C6H42.6±0.44.2±0.510.4±0.747.6±2.56f4-Br-C6H46.7±0.711.6±1.213.5±1.253.0±2.56g3-CF3-C6H48.2±0.516.8±1.618.4±1.650.8±3.76hH20.5±1.626.8±1.823.8±1.560.5±3.06iNH212.6±0.711.6±0.616.8±1.452.8±2.66jc-Pr16.7±1.532.5±2.421.7±1.557.8±2.46kHO2CCH225.8±2.135.8±3.038.6±2.567.8±4.26lbenzyl22.5±1.631.7±2.635.4±3.064.7±3.2Doxorubicin2.5±0.62.7±0.54.2±0.53.8±0.6Pefloxacin>100>100>10067.2±3.6

3 结果与讨论

由培氟沙星(1)制备化合物3的文献方法[10]是化合物1经硼氢化钠还原并脱羧得到2,3-二氢氟喹诺酮，再与甲酸乙酯缩合得到氟喹诺酮-3-甲醇，然后用活性二氧化锰氧化得到相应的醛3。该方法中与甲酸乙酯缩合反应步骤需要绝对无水操作，经多次尝试制备氟喹诺酮-3-甲醇未能成功。同时，试图通过酰肼2与磺酰氯的磺酰化产物C-3酰基磺酰肼通过McFadyen-Stevens反应[11]到醛3。但该方法需要在高温160 ℃下在较短的时间(<5 min)内完成，操作难度较大。最后，借鉴甲氧苄啶合成中间体三甲氧基苯甲醛的合成方法[12]，用酰肼2在稀氨水-氯仿介质中用铁氰化钾氧化脱肼基的方法可得到相应的氟喹诺酮-3-甲醛(3)。该方法虽收率中等(约为40%)，但可在室温水相中进行，条件温和方便，可规模化制备，不失为氟喹诺酮羧酸转为氟喹诺酮醛的简便方法。绕丹宁衍生物5a～5l可由相应的胺类4a～4l与双(羧甲基)三硫代碳酸酯在水中缩环合而得[9]。为此，制备得到的氟喹诺酮-3-甲醛(3)与绕丹宁衍生物5a～5l发生Claisen-Schmidt缩合反应到目标化合物6a～6l。

体外抗细胞增殖活性结果表明，12个目标化合物对3种试验肿瘤细胞株的IC50均低于40.0 μmol/L，显著强于母体培氟沙星(100 mol/L)的活性。同时，构效关系表明，绕丹宁环3-位含有卤代苯基化合物(6d、6e、6f)的抗肿瘤活性强于其他取代基，尤其对A549细胞株的IC50均在微摩尔浓度，与对照抗肿瘤药阿霉素相当。更有意义的是，12个目标化合物对正常非洲绿猴肾细胞株Vero的IC50显著高于对照阿霉素，显示出一定的选择性和较低的细胞毒作用，具有成药性研究的价值。

4 结 论

氟喹诺酮羧酸可通过其酰肼的铁氰化钾氧化反应方便制备相应的氟喹诺酮醛，然后与绕丹宁衍生物发生Claisen-Schmidt缩合反应构建氟喹诺酮-3-甲叉基绕丹宁类目标化合物。体外抗细胞增殖活性实验表明，所合成的12个目标化合物的抗肿瘤活性显著强于母体培氟沙星，部分化合物的活性与对照阿霉素相当，且对正常细胞显示出较低的细胞毒作用，体现出一定的选择性。为此，由绕丹宁环稠合修饰的α，β-不饱和酮作为C-3羧基的等排体有利于提高氟喹诺酮的抗肿瘤活性。