臧 嘉，李 闯，王 瑞，吴 芹，邬敏辰

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 无锡医学院，江苏 无锡 214122）

木聚糖酶（xylanases，EC 3.2.1.8）从木聚糖分子主链的内部随机切割β-1，4-D-木糖苷键，产生带有或无侧链基团的寡聚木糖。基于一级结构的同源比对及疏水簇分析，大多数木聚糖酶归属糖苷水解酶10和11家族[1]。目前商品化的木聚糖酶多数为最适温度Topt在40～55℃的中温酶，然而酶在使用过程中如纸浆漂白 （～70℃）和饲料加工 （～80℃）等经常会遭遇或需要高温环境[2]。因此，耐热性差已成为制约木聚糖酶发展的瓶颈。

影响蛋白质热稳定性的因素有：N或C末端、二硫键、盐桥、氢键和氨基酸相互作用等[3]。EvXyn11TS是已发现的11家族中极少数耐热木聚糖酶之一[4]。本实验室前期研究表明，EvXyn11TS耐热性与其N端区域密切相关。文献[2]用EvXyn11TSN端38个氨基酸替换AuXyn11A N端33个残基，杂合酶AEXynM的Topt和耐热性分别提高了20和30℃，表明EvXyn11TSN端对酶温度特性的重要性。文献[5]利用定点突变证实了EvXyn11TSN端二硫键（Cys5-Cys32）是其具有高耐热性的主要因素。用EvXyn11TSN端42个氨基酸替换AoXyn11A对应的37个残基获杂合酶AEx11A，再去除AEx11A N端二硫键获突变酶AEx11AC5T[6]。分析表明，AoXyn11A N端区域替换前后的Topt分别为50和75℃，而AEx11AC5T的Topt为60℃，由此可见，EvXyn11TSN端对其耐热性的影响是多因素协同作用的结果。

本研究拟采用生物学程序或软件分析比对EvXyn11TS与同一家族其他木聚糖酶的一级和三维结构尤其是在N端区域的异同点，以期解析EvXyn11TSN端区域的耐热性机制，为与其一级结构同源性高、比活性高和酶学性质优良的中温木聚糖酶的耐热性改造提供理论基础。

1 分析方法

1.1 11家族木聚糖酶的获取

以EvXyn11TS序列（GenBank：ACB87631） 为模板，在 GenBank 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中借助BLAST搜寻与模板一级结构同源性大于55%、不同来源的11家族木聚糖酶，去除重复和不完整序列，并查阅相关文献，获一级结构完整且温度特性已知的30种木聚糖酶。

1.2 木聚糖酶一级结构的分析

运 用 ClustalW2 程 序 （http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/）将EvXyn11TS和30种木聚糖酶进行多序列同源比对。使用MEGA 5.1软件（http：//www.megasoftware.net/）构建木聚糖酶进化树，从中选择包含EvXyn11TS在内的代表性耐热和中温酶。使用DNAMAN 6.0软件对代表性酶N端区域的异同点进行分析和比对。

1.3 木聚糖酶三维结构的同源建模

在 PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/） 中查找木聚糖酶的晶体结构；对晶体结构未知的，以EvXyn11TS晶体结构 （PDB：2VUL）为模板，运用MODELLER 9.11 程 序 （http：//salilab.org/modeller/）和PyMOL软件（http：//pymol.org/）对酶三维结构进行同源建模和分析。

1.4 木聚糖酶三维结构的分析

运用 Gromacs 4.5 程序包（http：//www.gromacs.org/）对木聚糖酶三维结构进行分子动力学模拟。使用g_rmsf软件计算酶分子各个氨基酸的根均方涨落（RMSF）值，将其导入木聚糖酶三维结构文件中，采用B-FITTER和Excel软件计算和处理B-factor值，按照氨基酸序号绘制B-factor图谱。通过比对耐热与中温酶的B-factor值，找出两类酶差异性大的区域。使用g_rms软件计算酶的根均方偏差（RMSD）值，分析β-折叠股A1对酶耐热性的贡献。 使用 PIC 软件（http：//crick.mbu.iisc.ernet.in/） 对木聚糖酶N端的二硫键、盐桥和疏水性作用等进行分析和比对。采用 PoPMuSiC在线程序（http：//dezyme.com/）预测EvXyn11TSN端各个氨基酸饱和突变前后酶蛋白折叠自由能的变化值（ΔΔG）。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶进化树的构建

基于多序列同源比对，采用Neighbor-Joining法构建了木聚糖酶的进化树（图1），计算模型选择Poisson Correction，使用 Bootstrap 检测（Replications=10 000）以确保进化树具有较高的可信性。根据酶蛋白的亲缘关系，将它们分为A、B两组。A组为18种原核生物木聚糖酶，与EvXyn11TS的同源性均大于60%；B组为13种真核生物木聚糖酶。EvXyn11TS、Tfl08 和 Umi17 为耐热酶[4，7-8]，其余 28 种为中温酶。

图1 31种11家族木聚糖酶的进化树Fig.1 A phylogenetic tree of 31 xylanases belonging to family 11

2.2 代表性木聚糖酶的选择

从进化树中选择了涵盖不同种属来源的，且一级结构同源性分布广的8种代表性耐热和中温木聚糖酶（图1以粗字体表示），用以分析和比对它们在N端的异同点。2种耐热酶EvXyn11TS和Umi17的Topt分别为 75℃和 80℃；6种中温酶 Ssp02、Cfi12、Bsu15、Tre20、Aor27 和 Vda29 的Topt在 45～55℃（表 1）。一级结构比对显示，7种酶分别与EvXyn11TS的序列同源性分布在55.3%～74.4%。

2.3 木聚糖酶N端区域的异同点

2.3.1 N端区域的比对 将8种代表性木聚糖酶进行了多序列同源比对（图2）。相对于其他区域，8种酶在N端 （红线框出部分）总体序列的保守性极差，而耐热酶EvXyn11TS和Umi17两者序列的同源性相对较高，推测11家族木聚糖酶的耐热性与其N端密切相关。此外，耐热酶的N端存在一个二硫键（蓝线框出部分），且比中温酶多出一个β-折叠股A1。

表1 8种代表性木聚糖酶的温度特性Table 1 Temperature properties of eight representative xylanases

文献[15]研究表明，蛋白质构象的刚性是评价其耐热性的一个重要指标，与蛋白质各位点处氨基酸的B-factor值成负相关性。基于此，运用Gromacs 4.5对4种酶的三维结构进行了分子动力学模拟（300 K，15 ns），其中酶分子 N 端（1～51 个氨基酸，以EvXyn11TS一级结构的序号为基准）的B-factor图谱如图3所示。由图3可见，3种中温酶多个位点处氨基酸的B-factor值明显高于EvXyn11TS的，表明后者N端的刚性或耐热性较高，与文献[2，6]相符。

图2 8种代表性11家族木聚糖酶的多序列比对Fig.2 Multiple alignment of eight representative 11 family xylanases

图3 EvXyn11TS和中温木聚糖酶N端各位点处氨基酸的B-factor值Fig.3 B-factor values of amino acids at the N-termini of EvXyn11TSand mesophilic xylanases

2.3.2 氨基酸组成Kumar等[3]统计发现，耐热菌中蛋白质的Arg、Glu、Leu和Pro（称为耐热有利氨基酸） 含量高于常温菌， 而 Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp和Gly（称为耐热不利氨基酸）低于常温菌，这可能是由于在高温环境下某些氨基酸不稳定或侧链太小对整个蛋白质刚性造成不利的影响[16]。本研究统计了8种木聚糖酶N端的氨基酸组成 （表2）。结果显示，EvXyn11TSN端的耐热有利和不利氨基酸含量分别为13.7%和54.9%，其他酶的耐热有利和不利氨基酸含量分别小于7%和大于60%，推测N端耐热有利或不利氨基酸含量的显著差异是EvXyn11TS耐热性高的原因之一。

2.3.3 β-折叠股A1RMSD值是指在模拟高温下某一时刻的蛋白构象与初始构象之间所有原子的根均方偏差值，RMSD值越小，蛋白质构象的刚性越强或热稳定性越高[5]。图2显示了耐热酶EvXyn11TS或Umi17较中温酶在N端区域多出一个β-折叠股A1。对EvXyn11TS去除A1前后的三维结构进行了分子动力学模拟（500 K，10 ns），模拟过程到达平衡后（>5 ns），去除 A1的EvXyn11TS的RMSD值明显高于EvXyn11TS的（图4），表明前者构象的刚性显著降低。文献[17]曾在木聚糖酶AoXyn11A的N末端引入由5个氨基酸组成的β-折叠股，增加该部位与β-折叠股A2的相互作用，提高了酶的刚性和热稳定性。

表2 8种木聚糖酶N端耐热有利和不利氨基酸的含量Table 2 Contents of amino acids at the N-termini of 8 xylanases favorable and unfavorable to thermostability %

图4 EvXyn11TS去除β-折叠股A1前后的RMSD值Fig.4 RMSD values of EvXyn11TSbefore and after removing β-strand A1

2.3.4 氨基酸的相互作用8种木聚糖酶的盐桥和二硫键数目统计显示，2种耐热酶EvXyn11TS（图5）和Umi17 N端均包含2个盐桥和1个二硫键，而6种中温酶仅Cfi12拥有1个盐桥。文献[18]获得了耐热性提高的突变木聚糖酶XylAG13R，三维结构分析发现，D11与R13形成的盐桥对耐热性有促进作用。文献[19]在AoXyn11A的N端引入1个二硫键，所获突变酶AoXyn11AM的Topt有一定的提高。

图5 EvXyn11TSN端区域的盐桥和二硫键Fig.5 Salt bridges and disulfide bond at the N-terminus of EvXyn11TS

在11家族木聚糖酶N端区域，2个芳香族氨基酸苯环之间距离小于7.0 Å时产生相互作用，通过锚定酶分子N端的β-折叠股B1、B2和A2来增强该区域的刚性，进而提高酶的热稳定性。通过对8种木聚糖酶N端三维结构的分析和比对，耐热酶EvXyn11TS和Umi01包含相对较多的这种相互作用，如EvXyn11TS13和18位的氨基酸为Phe，两者的相互作用增强了B1与B2间的刚性（图6）。文献[20]研究发现，在中温酶中引入芳香族氨基酸（T11Y）显著提高了酶的热稳定性。

图6 EvXyn11TSN端区域Phe13-Phe18的相互作用Fig.6 Interaction between Phe13and Phe18at the N-terminus of EvXyn11TS

2.3.5 特殊氨基酸His的咪唑环是良好的氢供体和受体，较其他氨基酸更易形成氢键[21]。EvXyn11TSN端在14位存在一个His，在三维结构上His14不仅能与Gly16和Phe17形成主链-主链氢键，也能与Leu34形成主链-侧链氢键；而6种中温酶有4种在对应位点处非His。文献[22]在“Pro理论”中指出，在主链构象不发生骤变的前提下，向β-转角或无规卷曲处引入Pro，能通过降低去折叠时的熵来提高蛋白质的热稳定性。在α-葡萄糖苷酶耐热性的研究中，文献[23]分别将位于其loop结构中的4个氨基酸突变为Pro，结果表明，其中有三个突变酶的热稳定性得到了不同程度的提高。EvXyn11TSN端存在2个位于9和26位的Pro，分别处于连接β-折叠股A1与B1以及B2与A2的loop结构的β-转角处。

当蛋白质由氨基酸突变产生的ΔΔG为正值时，则认为突变前其构象稳定[24]。EvXyn11TSN端的His14除突变为 Ile和Tyr时 ΔΔG几乎无变化外（分别为0和-0.03 kcal/mol），突变为其他17种氨基酸时ΔΔG为正值；Pro9和Pro26分别突变为其他任意一种氨基酸时ΔΔG均为正值。由此推测His14、Pro9和Pro26的存在使EvXyn11TS具有较低的折叠自由能，是其具有耐热性的关键因素。

3 结 语

木聚糖酶尤以11家族的是工业应用最广泛的酶类之一。如何提高木聚糖酶的耐热性以适应使用过程中的高温环境，已成为当前研究的热点。本研究基于11家族耐热和中温木聚糖酶在N端区域的差异性分析，预测了EvXyn11TSN端区域可能赋予其高耐热性的主要因素有：较高的耐热有利氨基酸含量、多出的β-折叠股A1、较多的氨基酸相互作用及特殊氨基酸的存在等。本文对EvXyn11TSN端耐热机制的解析，将为中温木聚糖酶的耐热性改造提供新的思路。