温度、二硫苏糖醇、基因定点突变对溶菌酶和肽基脯氨酰顺反异构酶蛋白交联反应的影响

徐燕邵世滨董立1闫晓华1高音2

(山东医学高等专科学校生物化学教研室，山东临沂276002)

摘要〔〕目的研究二硫键对溶菌酶和肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)蛋白交联聚集作用的影响。方法以人总RNA为模板设计引物进行人类PPI基因的克隆，以获取的正常型表达载体为模板，利用PCR定点突变的方法破坏掉PPI 基因中形成二硫键的两个半胱氨酸残基(Cys)，将其构建到pTrcHisC-hppI原核表达系统，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达获得正常型和突变型PPI蛋白，与溶菌酶在不同温度、还原剂二硫苏糖醇(DTT)存在条件下进行蛋白聚集反应，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹法分析和鉴定交联情况。结果溶菌酶和PPI在临界变性温度时有明显的二聚体和多聚体条带；反应体系中加入DTT后，几乎观察不到交联条带，两者的异源蛋白交联反应出现同样的现象；将突变型PPI置于与正常型PPI完全相同的反应条件下，均没有任何蛋白聚集现象。结论二硫键是蛋白质交联和多聚化发生的前提，破坏二硫键将导致蛋白结构和交联作用的丧失。

关键词〔〕二硫苏糖(DTT)；二硫键；定点突变；肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)交联

中图分类号〔〕R39〔文献标识码〕A〔

基金项目：山东省高等学校科技计划项目(J13LK18)

1山东医学高等专科学校检验系2首都师范大学生命科学学院

第一作者：徐燕(1979-)，女，硕士，讲师，主要从事蛋白质工程研究。

人类肽基脯氨酰顺反异构酶(hPPI)是可以催化脯氨酸残基发生构象折叠反应的酶，参与多种疾病的发生，特别是病毒性疾病的感染过程〔1～3〕。本实验利用还原剂二硫苏糖醇(DTT)处理PPI活性蛋白，破坏其二硫键观察对其蛋白聚集作用的影响。同时，利用PCR定点突变技术，突变PPI中的两个半胱氨酸残基为丝氨酸，从而改变蛋白的一级结构，检测对PPI蛋白高级结构以及聚合交联作用的影响。

1材料与方法

1.1正常型与突变型PPI蛋白的制备PPI取自实验室保存的293T细胞系，于液氮复苏后于培养箱培养，用含10%的胎牛血清的DMEM完全培养基在5%的CO2条件下进行培养。24 h后收集细胞用Trizol法进行总RNA的提取。利用前面提取的人总RNA为模板设计引物进行PPI基因的克隆。序列信息如下：正向引物CTGCAGATGGTCAACCCCACCGTGTTCT和反向引物GAATTCTGACTGTGGACAACTCGAATAA。然后以cDNA为模板和克隆引物进行PCR扩增PPI基因的编码区序列。克隆获得PPI基因经测序正确无误后，将其构建到pTrcHisC-hPPI原核表达系统的多克隆位点区域，从而构建含6个组氨酸的融合蛋白。载体构建成功后，利用终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(北京鼎国生物科技有限公司)进行诱导表达以获取大量的目的蛋白，表达后的产物少量提取后用12%的十二烷基磺酸钠-丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。鉴定正确后，再进行大量蛋白的提取和纯化。利用Talon金属亲和层析树脂纯化柱纯化目的蛋白，将纯化后的蛋白利用BCA法(大连宝生物)进行蛋白浓度测定，用于交联反应。通过分析PPI的编码区序列发现该基因一共含有两个半胱氨酸(Cys)分别位于52和62位。利用定点突变的方法将这两个氨基酸突变为丝氨酸从而破坏其二硫键形成的可能性。以获取的正常型的表达载体为模板，设计定点引物正向引物mu为GTTCCTCCTTTCACAGAATTATTCCAGGGTTTATGTCCCAGGGTG和反向引物mu为CACCCTGGGACATAAACCCTGGAATAATTCTGTGAAAGGAGGAAC进行PCR扩增，从而实现PCR产物的突变。测序正确后如同正常型载体表达和纯化过程进行突变型PPI蛋白的诱导表达和纯化，用于下一步的交联反应。

1.2蛋白质的体外交联反应

1.2.1温度对溶菌酶(Lysozyme)和PPI交联的影响将纯化的PPI冻干浓缩后，与溶菌酶在4个反应体系中培养40 min，SDS-PAGE分析交联情况。见表1。

表1溶菌酶和hPPI的热变性交联反应(mmol/L)

Tris-clGSHGSSG溶菌酶PPI温度(℃)130210.2075230210.20.575330210.20.544302100.575

1.2.2变性剂DTT和定点突变对溶菌酶和两种PPI蛋白交联的影响在与上相同的缓冲体系中，热变性交联温度下，SDS-PAGE分析DTT和点突变对同源和异源蛋白交联的影响。

1.3Western印迹鉴定将电泳样品转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，与兔抗人PPI一抗4℃孵育过夜。经缓冲液TBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔PPI抗体，37℃孵育60 min，增强型化学发光法(ECL)鉴定交联结果。

2结果

2.1温度影响蛋白质交联溶菌酶和PPI在4℃没有任何交联，而在热变性的75℃有明显的二聚体和多聚体条带。PPI的分子量为24 kD，故溶菌酶的三聚体与两者的异源二聚体分子量相差不大。为排除上述干扰，进行Western 印迹鉴定表明，第3条带为异源二聚体交联。见图1。

蛋白marker分子量分别14.4、20、26、33、45、66.2、94 kD 图1　温度对蛋白质交联影响的SDS-PAGE和 Western印迹分析

2.2变性剂DTT影响蛋白质交联75℃变性条件下进行交联实验，溶菌酶蛋白可以形成同源二聚体和多聚体(第2条带)；但是当添加DTT变性剂的条件下，几乎检测不到二聚体和多聚体的存在，同源蛋白的聚合作用消失(第3条带)。同样，对于PPI蛋白，75℃变性条件下可以检测到二聚体和多聚体的同源聚合作用(第6条带)，但是在DTT存在的情况下，PPI蛋白出现类似于溶菌酶的结果，同源蛋白不发生聚合作用(第7条带)。两者的异源蛋白交联反应出现同样的结果(第4、5条带)。Western印迹分析同样支持上述结果。这说明DTT可以破坏二硫键的形成，从而阻止同源和异源蛋白的聚合作用，即便在适宜交联的温度下，也不能形成聚合复合物。见图2。

2.3定点突变破坏蛋白质交联正常型的PPI蛋白在临界变性温度75℃的交联作用下发生聚合作用，形成二聚体和多聚体(第2条带)。而突变型PPI蛋白在临界变性温度75℃的交联作用下不发生同源聚合作用，SDS-PAGE与Western印迹均未检测到蛋白的聚合作用(第3条带)。同样两种检测方法表明，溶菌酶与突变型PPI的混合液仅出现了溶菌酶聚合反应，未出现异源蛋白交联(第3条带)。这说明，在交联反应的过程中，二硫键起到至关重要的作用，一旦不可逆地破坏二硫键的存在，将导致同源和异源蛋白聚合作用的消失。见图3。

蛋白marker分子量分别14.4、20、26、33、45、66.2、94 kD。交联温度为75℃ 图2　变性剂对蛋白交联聚合作用的SDS-PAGE和 Western印迹分析

marker为14.4、20、26、33、45、66.2和94 kD。交联温度为75℃ 图3　两种PPI蛋白与溶菌酶交联反应的 SDS-PAGE和Western印迹分析

3讨论

蛋白质易受外界因素影响而发生构象变化，物理化学性质发生异常变化，最终导致蛋白活性丧失。而蛋白的构象则主要源于蛋白一级结构为基础进行折叠、聚合等过程，形成有活性的高级结构。而在这个过程中，分子键起到关键的作用，特别是二硫键。二硫键是最为常见的蛋白质结构修饰，对稳定蛋白质的空间结构，调节蛋白活性有着非常重要的作用。利用PCR技术对人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)囊膜蛋白(Env)七肽重复区HRI和HR2之间linker进行定点突变破坏二硫键的形成，将导致该蛋白活性的改变，不能正确识别和定位〔4〕。通过比较被拆分不同数目二硫键的人转铁蛋白和正常蛋白的活性，检测二硫键对它们结合金属离子和与转铁蛋白受体的结合能力，结果表明随二硫键被拆分数目的增加，其与受体结合能力比结构金属离子能力的丧失快〔5〕。在研究朊病毒蛋白分子的活性中发现，重组正常人朊病毒蛋白经沉淀实验显示经过二硫键硫醇基团的氧化还原之后其蛋白聚集性显著增加，而二硫键破坏的突变体蛋白则没有明显变化〔6〕。风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1外功能区的10个二硫键对RV的细胞融合活性都有重要影响，任何一个二硫键的去除均导致E1的细胞融合活性丧失〔7〕。可见，二硫键对蛋白活性的发挥起到至关重要的作用。同时，二硫键很容易被还原而断裂，但是断裂后在适当的条件下又可以氧化反应重新形成二硫键，因此二硫键形成是一个动态过程。

根据以往研究〔8〕，溶菌酶和PPI的热变性交联温度均在75℃左右。此次研究发现，温度同样影响异源蛋白质交联。DTT是一种很强的还原剂，其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环(含二硫键)的构象稳定性。DTT常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键，能够保护正常晶体蛋白所含的半胱氨酸等成分不受氧化修饰，减少其变性可能性。二硫键在维持蛋白稳定性和蛋白聚合过程中发挥重要作用。本实验针对PPI蛋白进行定点突变，将PPI蛋白中存在的两个半胱氨酸全部进行突变为丝氨酸，从而阻断PPI蛋白二硫键的形成，试验体外研究二硫键对PPI蛋白聚合作用的影响。本实验证实，变性剂DTT通过破坏二硫键可以导致同源和异源蛋白的聚合作用，即便是在变性条件下进行交联，依然检测不到聚合复合物，说明DTT对二硫键的破坏是不可逆作用，同时也表明了化学变性剂对蛋白交联聚合的影响。另一方面，通过定点突变半胱氨酸，破坏PPI蛋白的一级结构进而破坏其二硫键，导致同源蛋白和异源蛋白都不发生聚合作用。同时，在异源交联反应实验中，检测到PPI和溶菌酶发生异源聚合作用，说明聚合反应是蛋白的一个非特异性特征，只要条件适当，异源蛋白同样会发生聚合作用。这些实验再次验证了前期本课题组所提出的提出了蛋白质交联机制的三步假说〔9〕：第一步蛋白质构象包括二级结构改变；第二步形成分子间二硫键；第三步形成分子间异肽键。DTT破坏二硫键的形成，从而阻断了交联反应的第二步导致聚合作用抑制。而蛋白一级结构的改变，特别是半胱氨酸的改变，将直接导致二硫键形成受阻，从而改变蛋白的二级结构以及后续的交联作用。可见，二硫键是蛋白质交联和多聚化发生的前提，破坏二硫键将导致蛋白结构和交联作用的丧失。因此，可以利用二硫键的对交联作用的影响应用于临床。

4参考文献

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5严民宏,冯佑民.人转铁蛋白二硫键的拆分对其结合金属离子以及受体结合能力的影响〔J〕.生物化学与生物物理学报,1994;26(1):15-9.

6孙晗.二硫键对人朊蛋白生化特性和功能的影响〔D〕.河北大学,2012.

7刘晓丽,吴冰,王志玉.风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对其细胞融合活性的影响〔J〕.病毒学报,2009;25(2):101-6.

8周霞，刘凤华，席惠,等.人肽基脯氨酰顺反异构酶基因的克隆、克隆、表达、纯化及热变性交联〔J〕.首都师范大学学报(自然科学版)，2004;25(2):52-6.

9Gao Y,Mehta K.Interchina disufide bonds promote protein cross-linking during protein folding〔J〕.J Biochem,2001;129(1):179-83.

〔2013-12-27修回〕

(编辑苑云杰)