华洪葳，李先根，汪 洋，杨骁航，张思怡，杨雨航，刘玉兰，许 啸

（动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉 430023）

氧化应激在养猪生产中普遍存在。饲养管理水平低下、饲粮营养缺乏、环境变化以及细菌和病毒感染等因素均会诱导氧化应激反应，从而降低动物的免疫力和生产性能，继而诱发疾病，给生猪养殖业带来巨大的经济损失。肠道是重要的消化吸收器官，也是应激状态下最敏感、最易受损的器官[1]。近年来，铁死亡作为一种新鉴定的细胞死亡方式，因有别于传统的坏死、凋亡及自噬等细胞死亡方式而成为生命医学领域的研究热点[2]。Dixon等[3]在《Cell》杂志首次提出铁死亡的概念，指出铁死亡是一种依赖于脂质过氧化反应驱动的非凋亡性细胞死亡方式。铁死亡的发生主要靠2条信号通路共同调控：正调控的转铁蛋白受体1（Transferrin Receptor 1，TFR1）/Fe2+信号通路和负调控的胱氨酸/谷氨酸反向转运体（Cystine/Glutamate Transporter，System Xc-）/GPX4信号通路。本试验旨在用脂多糖（LPS）建立氧化应激模型，通过测定仔猪空肠上皮细胞铁死亡信号通路关键基因的mRNA表达量以及抗氧化能力，探究LPS刺激后不同时间空肠上皮细胞发生铁死亡的变化规律，以期更精准地了解仔猪肠道损伤的时间及机理，从而为今后缓解仔猪肠道损伤提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验动物 于湖北奥登农牧科技有限公司选购42头遗传基础和体重（7.17±0.41）kg的21日龄杜×长×大三元杂交断奶仔猪，试验在动物营养与饲料科学湖北省重点实验室进行。

1.2 试验设计及试验日粮 根据断奶仔猪体重和性别进行完全随机区组试验设计，按注射LPS（大肠杆菌血清型055：B5，购于Sigma公司）后时间随机分为7个处理，每个处理6个重复，每个重复1头猪。饲喂基础饲粮14 d后，按100 μg/kg BW剂量空腹腹膜皮下注射LPS，分别于0、1、2、4、8、12、24 h屠宰，并取空肠黏膜样品。取样具体方法：将10 cm左右肠段用剪刀沿肠系膜纵向剖开，4℃生理盐水轻轻冲洗肠壁内容物，用滤纸吸干水分，然后用载玻片轻轻刮取肠黏膜，分装在1.5 mL无菌管中，立即放入液氮速冻，然后转入-80℃冰箱中冻存。基础日粮参照NRC（2012）进行配制（表1）。

1.3 mRNA表达量的测定 空肠黏膜细胞相关关键基因包括膜蛋白转铁蛋白受体1（TFR1）、热休克蛋白B1（HSPB1）、铁反应元件结合蛋白2（IREB2）（铁死亡信号通路正调控）；谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、胱氨酸/谷氨酸反向转运体亚基（SLC7A11）（铁死亡信号通路负调控）。以上基因mRNA表达量采用实时定量PCR（Real-time PCR）法测定，根据已在NCBI上发表的猪的基因序列，用Primer premier 6.0软件设计Real-time PCR引物，再由北京擎科新业生物技术有限公司合成（表2）。用于合成的cDNA模板，采用20 μL反应体系：10.0 μL SYBR® Premix Ex TaqTM（2×），0.4 μL ROX reference dye II（10×），2.0 μL cDNA，6.8 μL RNase free dH2O，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.4 μL。使用ABI 7500 Real-time PCR仪进行扩增。循环参数：首先 95ºC 30 s；随后进行 95ºC 5 s，60ºC 34 s，40 个循环。每份样本做3个重复。本试验将GAPDH作为内参基因，各基因的mRNA表达量采用2-DDCT相对定量法计算，各基因的mRNA相对表达量用归一化法处理，以相对于对照组的表达量表示。

1.4 空肠上皮细胞抗氧化指标的测定 总抗氧化力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、谷胱甘肽（GSH）含量和丙二醛（MDA）水平采用分光光度计测定，具体步骤按照试剂盒说明书。试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司。

1.5 统计分析 用Excel 2010软件处理实时定量PCR的结果，用SPSS 22.0对LPS刺激后不同时间点mRNA的表达量以及抗氧化指标进行Duncan's多重比较。结果表示为平均值±标准差，P＜0.05为显著性差异。

2 结 果

2.1 LPS刺激后不同时间的铁死亡关键基因mRNA表达量的变化 由图1可知，LPS刺激后不同时间，空肠上皮细胞铁死亡关键基因TFR1、HSPB1、IREB2、SLC7A11和GPX4的mRNA表达量差异显著（P＜0.05）。LPS刺激后8 h，TFR1、HSPB1、IREB2、GPX4的mRNA表达量最大；LPS刺激后2 h，SLC7A11的mRNA表达量最大。

表1 日粮组成及营养成分（饲喂基础）

2.2 LPS刺激后不同时间的断奶仔猪空肠上皮细胞抗氧化指标的变化 由图2可知，LPS刺激后不同时间，空肠上皮细胞抗氧化指标T-AOC、GSH和GSH-Px差异显著（P＜0.05），MDA水平则无显著性差异（P＞0.05）。其中，在LPS刺激后8、12、24 h，T-AOC及GSH-Px活性均显著降低（P＜0.05）；LPS刺激后8 h，GSH浓度达到最低（P＜0.05）。

图1 LPS刺激后不同时间断奶仔猪空肠上皮细胞铁死亡关键因子mRNA的表达变化

图2 LPS刺激后不同时间断奶仔猪空肠上皮细胞抗氧化指标的变化

3 讨 论

铁死亡是一种全新的细胞死亡模式，它在形态学和生物化学方面与其他细胞死亡方式均有明显不同。在形态学方面，发生铁死亡细胞的细胞膜完整且皱缩、线粒体体积缩小、线粒体嵴减少或消失、线粒体外膜破裂等[3]。在生化方面，发生铁死亡细胞的GSH耗竭，GPX4活性下降，脂质氧化物不能经GPX4催化的谷胱甘肽还原反应代谢，继而二价铁离子以芬顿（Fenton）反应的方式氧化脂质产生大量活性氧（ROS），促使细胞发生铁死亡[4]。

现已证实细胞铁死亡有其独特的信号转导通路，它需要细胞内TFR1/Fe2+与System Xc-/GPX4信号通路的双重反馈调节，铁死亡的信号通路在近些的研究中正逐步被揭开。铁元素是几乎所有生物必须的微量元素，它是各种重要酶的活性中心，发挥着重要的生理作用[5]。TFR1是细胞膜上的膜蛋白转铁蛋白受体1，细胞发生铁死亡时，铁以三价铁（Fe3+）形式首先在TFR1作用下被转入细胞内并定位到核内体上，随后被前列腺6次跨膜上皮抗原3（STEAP3）的铁氧还原酶还原成二价铁（Fe2+）。本试验表明，TFR1表达量在LPS刺激后8 h时最大，说明此时Fe3+向胞内的转运速率达到最大，铁死亡发生最为剧烈。Imai等[4]研究表明，当机体受到刺激时，细胞会增加铁摄入或减少铁的存储导致铁池中铁过载，过载的Fe2+可通过芬顿反应氧化脂质产生ROS，从而损坏细胞器导致细胞铁死亡。本试验中，TFR1表达量的变化趋势间接证实了氧化应激状态下有大量Fe3+进入胞内，与Imai等[4]的研究结果相一致。Gao等[6]研究表明，HSPB1（Heat Shock Protein B1）在铁摄取的过程中可通过抑制TFR1的表达而降低细胞内铁离子浓度，因此过表达的HSPB1会抑制铁死亡。本试验中，HSPB1的表达量也是在LPS刺激后8 h达到最大，此时细胞自身保护，在最大程度上抑制铁死亡。另有研究发现，抑制铁代谢的主要转录因子IREB2可间接抑制erastin诱导的铁死亡[7]。总之，本试验中铁死亡关键因子mRNA表达量呈先升高后下降的趋势，当LPS刺激后8 h，断奶仔猪空肠上皮细胞的TFR1、HSPB1、IREB2的表达量均达到最大，TFR1表达量不断上升说明空肠上皮细胞内的Fe3+在不断积累，并向Fe2+形式转化，发生芬顿反应，细胞发生铁死亡；同时，机体抑制铁死亡的自我保护因子HSPB1和IREB2的表达量提高，也说明空肠上皮细胞随着铁死亡的加剧，机体自我保护系统启动。

表2 引物序列、目的片段及登录号

细胞内存在多种抗氧化通路可清除过量ROS，研究表明与细胞铁死亡有密切关系的为system Xc-/GPX4信号通路[4]。System Xc-（由SLC7A11和SLC3A2 2个亚基通过二硫键组成，SLC7A11是决定System Xc-表达量的关键亚基）可将谷氨酸转出细胞，同时将胱氨酸转入细胞，随后胱氨酸转化为半胱氨酸并合成GSH。GSH可在GSH过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPX）的作用下还原ROS，从而保护细胞免受损伤[8]。但当机体处于应激状态时，体内抗氧化酶活性下降，特别是特异性抑制铁死亡的GPX4活性降低，从而导致ROS攻击线粒体膜和细胞膜，最终使细胞发生铁死亡[9]。本试验中，LPS刺激断奶仔猪8、12、24 h后，空肠上皮细胞的T-AOC显著下降，且刺激24 h后，T-AOC降到最低，说明LPS刺激降低了断奶仔猪的抗氧化系统，使机体发生了氧化应激。空肠上皮细胞的GSH含量呈先下降后上升趋势，在LPS刺激后8 h达到最低，说明机体在LPS刺激后8 h氧化应激最为严重，机体内有大量ROS积累，这与铁死亡相关基因表达量达到最高相一致。本试验中，SLC7A11在LPS刺激后8 h的表达量并未升高，这说明细胞并未在氧化应激条件下增加胱氨酸转入；同时，虽然在LPS刺激后8 h GPX4基因表达量和GSH含量有所提高，但GSH-Px活性并未提高，这说明肠黏膜细胞的抗氧化水平降低。Zeng等[10]和Xu等[11]研究发现，氧化应激可导致仔猪肠黏膜损伤，机体抗氧化酶活性降低，本试验结果与其一致。以上结果说明，氧化应激会导致仔猪肠黏膜细胞发生铁死亡。在养猪生产中，除了添加抗氧化剂提高仔猪的抗氧化能力外，还可添加抑制铁离子富集的阻断剂来缓解仔猪肠道损伤。进一步开展铁死亡关键调控因子的蛋白表达量和肠黏膜中Fe2+浓度的测定、细胞膜和细胞器的形态学变化观察，可更深入地了解铁死亡的机制与特点。

4 结 论

综上所述，在LPS刺激断奶仔猪后，空肠上皮细胞铁死亡相关因子的mRNA表达量改变，抗氧化能力下降，说明LPS刺激可诱导空肠上皮细胞发生铁死亡，并且在刺激后8 h空肠上皮细胞铁死亡程度最严重。