李 超，其日格日，赵启南，乌英嘎，康德措，赵一萍，格日乐其木格，芒 来

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室，农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站，内蒙古农业大学马属动物研究中心，内蒙古呼和浩特 010018）

在生物氧化的电子传递过程中，细胞色素C氧化酶4（COX4）是电子传递链上复合体4的1个关键亚基，它由COX4基因编码，主要功能把呼吸底物的电子经过细胞色素系统直接传递给分子态氧[1]。研究表明，COX4蛋白共有2个异构体，即COX4I1和COX4I2，两者在体内起到相反作用。在缺氧条件下COX4I1基因的表达被COX4I2基因所抑制，而在有氧条件下COX4I1基因率先表达[2]。膜脂肪酸结合蛋白（FABPpm）是由FABPpm基因编码了分子量为43 ku的FABPpm膜蛋白，主要定位在细胞质膜和线粒体膜上。Glatz等[3]指出，脂肪酸跨膜运输的基本过程是脂肪酸先与白蛋白形成复合体，再与质膜上的白蛋白形成结合白蛋白，最后脂肪酸被释放并被FABPpm蛋白转运至胞内。因此，认为FABPpm的表达水平与脂肪酸代谢水平密切相关。小窝是位于细胞膜上的颈状凹陷囊泡结构，小窝蛋白-1（CAV-1）是小窝主要结构蛋白和调节成分。CAV-1的α和β亚基均能结合脂肪酸，断定CAV-1是一种脂肪酸结合蛋白[4]，其主要作为脂筏的组成蛋白，并以脂筏为平台直接结合游离脂肪酸，参与脂肪酸的转运[5]。综上，COX4I2、FABPpm和CAV-1基因在分别在与高负荷运动相关生物氧化过程和脂肪酸分解过程中发挥了重要作用。

蒙古马作为耐力运动能力较为出色的马种，在高负荷运动中ATP的合成及脂肪酸的分解过程都极为重要。但以上3种基因在蒙古马中的研究较为少见，尤其是在高负荷运动训练前后基因表达量差异的研究还未见报道。本研究选取蒙古马臀中肌中与运动有关的3个基因（COX4I2、FABPpm和CAV-1）作为候选基因，检测高负荷运动训练前后转录水平mRNA的表达量，为今后马运动训练与基因表达相关方面的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集和训练方法 实验选择3匹5岁雌性蒙古马，高负荷运动前，空腹状态下将马匹麻醉后从臀中肌中采集肌肉样品（30 g），样品离体后，蒸馏水洗净并迅速剪成豆粒大小，放入已编号的无RNase Ep管中（Eppendorf），并置于液氮罐中带回实验室放入-80℃冰箱（Eppendorf）中保存。

待马匹得到充足休息后，开始进行高负荷运动训练。运动训练在一个直径30 m，周长100 m的圆形调教圈中进行。 训练期4个月，共计122 d，为避免运动损伤，训练计划将分为3个阶段，每阶段分若干周期，逐步提高运动训练强度。第1阶段为第1～15天：此阶段总计15 d，每5 d为1个周期，第1周期第1天运动8 km，第2～4天每日递增2 km，第5天休息；第2和第3周期训练循环方式同第1周期。这个阶段训练的主要目的是使肌腱、韧带和骨骼能够得到强化，帮助马匹适应后面的高强度训练。第2阶段为第16～108天：此阶段总计92 d，每4 d为1个周期，起始训练距离为15 km，每个周期中前3 d每日训练距离以5 km递增，第4天休息，如此循环。此阶段训练是为了使肌肉有氧适应性最大化，距离逐步增加，并及时下降回归，让训练马匹得到休息。使肌肉、心脏和肺脏等器官能够适应递增的高强度运。第3阶段为第109～122天：此阶段总计14 d，在这个阶段要尽可能延长训练时间和训练距离，起始训练距离为20 km，第2～4天训练距离以 10 km 递增，第5、6天休息，该阶段结束后，采取样品，方法同1.1。

实验用马在训练期间每天饲喂5次青干草，白天4次，夜间补饲1次，草量以半小时内吃完无剩余为准；每天饲喂 1 次精饲料，精饲料包括玉米、燕麦与麸皮，按照 4:4 :2 加水搅拌潮湿后供给，隔天在精饲料中加入葵花籽和食用盐。不限制饮水量，饮水经常更换以保持新鲜；马厩内长期挂盐砖和糖砖供其自由舔舐，补充微量元素。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA的合成 首先，将冻存在-80℃的蒙古马臀中肌肌肉样品放入装有液氮的研钵中，根据Trizol试剂（TaKaRa）总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，1%琼脂糖凝胶检测总RNA的完整性，微量紫外分光光度计（Thermo NANODROP 2000c）测定提取的总浓度。其次，使用RNA反转录试剂盒（TaKaRa）进行cDNA的合成，反应体系：5×PrimeScript Buffer2 4.0 µL、PrimeScript RT Enzyme Mix1 1.0 µL、RT Primer Mix 1.0 µL、RNase Free dH2O 4.0 µL、总RNA 10.0 µL，总反应体系为20 µL。反应条件为37℃、15 min，85℃、5 s，温度降到4℃时终止反应，经凝胶电泳检测后反转录产物在-20℃冰箱里保存备用。

1.2.2 引物设计 分别根据马运动相关的文献记录[6]，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，NC_009149）基因为内参基因，并选取肌肉中与马高负荷运动相关的3个基因为候选基因，即COX4I2（NC_009165.3）、FABPpm（NC_009146.3）和CAV-1（NC_009147.3），使用Primer Premier 3.0软件设计引物，并且通过NCBI中的Blast功能，检测各引物的特异性。设计完后由上海生物工程有限公司合成，具体引物信息见表1。

1.2.3 普通PCR 使用cDNA作为模板进行PCR扩增，扩增基因的目的片段采用三步法PCR扩增程序，95℃预变性5 min，98℃变性10 s，按各基因相应的退火温度（表1）退火30 s，72℃延伸1 min ，进行30个循环后4℃保存备用。

1.2.4 实时荧光定量PCR 荧光定量PCR是采用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）试剂盒（TaKaRa）在实时荧光定量PCR仪（Agilent Technolog-ies Strata gene Mx3000P，Agilent）上进行。反应体系总计20 µL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 µL，PCR Forward Primer 0.8 µL，PCR Reverse Primer 0.8 µL，cDNA模版2.0 µL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，ddH2O 6 µL。每个样品重复3管。

1.3 数据分析 实验采用 2-ΔΔCt（ΔCt=Ct目的基因—Ct内参基因）并以GAPDH为内参基因对蒙古马肌肉中与运动相关的3个基因进行运算和矫正。将得到的数据采用Excel 2016软件进行单因素方差分析和显著性检验，并利用GraphPad Prism 6进行绘图。

表1 引物序列参数

2 结 果

2.1 总RNA质量检测 1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样本呈完整清晰的28 S、18 S和5 S条带（图1-A），反转录后cDNA电泳图见图1-B。

图1 蒙古马臀中肌总RNA和反转录后cDNA

2.2 运动相关基因mRNA的相对表达量 由图2可知，高负荷运动训练后蒙古马臀中肌中COX4I2、FABPpm和CAV-1基因表达量均存在升高趋势，其中COX4I2和FABPpm差异显著（P＜0.05），而CAV-1在统计学上差异并不显著（P＞0.05）。

图2 训练前后蒙古马臀中肌中运动相关基因mRNA相对表达量

3 讨论与结论

近年来，关于COX4I2基因与运动关系的研究较多集中于人和小鼠以及纯种马上。COX4I2基因具有组织特异性，其在肌肉组织中的表达量显著高于其他组织[7]。研究表明，对8匹未经训练的纯种马进行标准化的渐进式踏车运动训练后，COX4I2基因在肌肉中的表达量显著高于运动前[8]。曹行[9]研究发现，伊犁马的COX4I2基因存在遗传多样性，其不同的基因型对伊犁马的运动能力有较大影响。因而，无论是COX4I2基因在肌肉组织中特异性高表达，还是通过运动训练提高了COX4I2基因表达量，以及不同基因型对动物运动能力的影响都印证了COX4I2基因与运动训练和能量代谢具有相关性，即COX4I2基因表达的增加为机体提供了更多的热量来保持体温及维持能量。本研究发现，在为期4个月的高负荷运动训练后，蒙古马臀中肌中COX4I2基因的表达量显著提高。由此可见，通过长期高负荷运动训练，能够增强线粒体活性，提供运动所需的能量。

Talanian等[10]对10名女性进行6周的高强度间歇训练后，骨骼肌细胞内FABPpm含量增加了48%。关于一次性力竭运动的研究表明，120 min的力竭运动可以使人类和大鼠质膜上的FABPpm蛋白含量分别增加20%和30%[11]。这说明FABPpm基因表达的增强与运动具有很大的相关性，不同的运动方式对FABPpm表达影响都具有相同的趋势，即FABPpm含量都增加；同时也可以看出，高强度间歇训练相比一次性力竭运动有更大影响。在生物体内，FABPpm基因表达可以被腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated Protein Kinase，AMPK）激活，AMPK 信号通路是调控脂肪代谢的关键通路[12]。FABPpm表达的升高很有可能是由于肌肉运动刺激AMPK，而后AMPK刺激FABPpm表达。本实验中，长期高负荷运动训练后蒙古马臀中肌中FABPpm基因表达有显著提高，这与以前的研究[10-11]基本一致，即运动增强了FABPpm基因在肌肉中的表达，因而长期高负荷运动在一定程度上能促进机体中脂肪的代谢。

CAV-1与脂肪代谢有着密切的关系。在动物实验中，CAV-1缺失的小鼠表现出明显的代谢紊乱，并且脂代谢严重受阻[13]，这表明CAV-1与脂肪代谢有密切关系。张荷等[14]研究表明，低氧运动可以显著增加大鼠肌肉中CAV-1蛋白含量，而在常氧的运动状态下大鼠CAV-1蛋白含量虽有增加，但增加趋势不显著。Oh等[15]研究发现，抗阻训练运动后CAV-1基因的表达与小鼠的肌肉纤维类型有关。本实验结果显示，蒙古马高负荷运动后，CAV-1基因表达量升高，但不显著。这可能是由于肌纤维类型差异所致，臀中肌中Ⅰ型、Ⅱa型和Ⅱx型肌纤维以不同比例存在；也可能由于运动训练方式差异所致。

综上所述，COX4I2、FABPpm和CAV-1基因与蒙古马的运动能力存在密切关系，可为今后蒙古马运动训练和相关基因的研究提供有价值的参考依据。