陈炜昊，田志龙，孙 伟，储明星

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；3.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003）

绵羊产羔性状遗传力只有0.05～0.15，常规育种手段难以满足现代畜牧业对于产羔性状改良的需求[1]。标记辅助选择能够极大提高低遗传力性状（如绵羊产羔性状）的选择效率，而找到与产羔性状位点相连锁的标记，则是实现标记辅助选择的基础[2]。研究表明，绵羊属于季节性繁殖动物，在光照逐渐缩短的秋冬季节开始性腺活动，在冬春之交时结束[3]，季节性繁殖活动主要受下丘脑—垂体—性腺轴（HPG）系统调控[4]，与生殖激素的变化密切相关。

基因组印记基因又称遗传印记基因，这类基因表达与否取决于它们所在染色体来源（父系或母系）以及在其来源染色体上该基因是否发生沉默[5]。研究表明，大多数印记基因可能是控制家畜生长发育与繁殖的主效基因[6]。Makorin环指蛋白3（Makorin Ring Finger Protein 3，MKRN3）基因为父本表达、母本印记的印记基因，属于M蛋白家族，因其在物种间保守性及在发育神经系统中高表达，在细胞中扮演着极其重要的作用[7]。人MKRN3基因定位于染色体15q11.2上，位于Prader-Willi综合征关键位置，该综合征表现为性腺随着人年龄增长出现机能衰退并出现生长激素缺乏等症状[8]。研究表明，MKRN3基因可能与信号转导、细胞周期调控、分化和形态发生等重要生物信息调控功能有关[9]，主要通过抑制HPG轴下游的目标发挥其生物学功能[10-11]。因此，推测MKRN3基因可能对绵羊的繁殖性状也有一定影响。本研究选择不同发情模式（季节性发情和常年发情）的绵羊品种，通过对绵羊MKRN3基因测序，探讨其多态位点与产羔性状的关联性，寻找新的多态位点，为进一步开展绵羊产羔机理的研究和分子标记辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 血样采集及数据测定 21只苏尼特羊血液样本采自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗民羊牧业有限责任公司，22只滩羊血液样本采自宁夏盐池县宁夏朔牧盐池滩羊繁育有限公司，161只草原藏羊血液样本采自西藏当雄县，101只湖羊血液样本采自江苏省徐州申宁羊业有限公司，52只策勒黑羊血液样本采自新疆和田市策勒县，380只小尾寒羊血液样品采自山东省郓城县诚联小尾寒羊种羊场。所有羊只营养以及管理水平保持一致，年龄相近，采用颈静脉采血，柠檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。同时记录小尾寒羊产羔季节、胎次与产羔数。

1.2 DNA提取 使用血液DNA试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取绵羊血液样本DNA，Nano Drop2000检测DNA样本浓度，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.3 基因分型 对MKRN3基因2个多态位点在常年发情和季节性发情绵羊品种中进行基因分型，采用Sequenom MassARRAY®SNP技术进行基因型检测[12]。分型样品为DNA，每个样品需要量为20 μL，DNA浓度为 40～80 ng/μL。

1.4 数据处理 采用Microsoft Excel 2016软件统计绵羊MKRN3基因2个多态位点的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（HE）和有效等位基因数（NE），并进行Hardy-Weinberg平衡检验。配合模型进行最小二乘分析：

其中，yijkl为产羔数的记录值，μ为群体平均值，LSi为第i个产羔季节的固定效应（i=1，2，3，4），Pj为第j个胎次的固定效应（j=1，2，3），Gk为MKRN3基因第k种基因型的固定效应（k=1，2，3），eijkl为随机残差效应（服从标准正态分布）。

采用SPSS 19.0软件程序中卡方独立性检验完成常年发情和季节性发情绵羊品种中基因频率与基因型频率差异显著性检验，并使用一般线性模型完成小尾寒羊基因型与产羔表型数据关联分析，所有数据以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 MKRN3基因多态性分析 根据基因分型结果，发现MKRN3基因g.275981C＞T位点存在CC、CT和TT共3种基因型；g.276999C＞T位点存在TT、TC和CC共3种基因型（图1）。

图1 MKRN3基因g.275981C＞T（上）、g.276999C＞T（下）位点分型结果

从表1可知，绵羊MKRN3基因g.275981C＞T位点基因型频率和等位基因频率在季节性发情、常年发情绵羊品种间差异不显著（P＞0.05），g.276999C＞T位点基因型频率和等位基因频率在季节性发情、常年发情绵羊品种间差异极显著（P＜0.01），且在季节性发情、常年发情绵羊品种中C均是优势等位基因。

从表2可知，绵羊MKRN3基因g.275981C＞T位点在6个绵羊品种中均表现为低度多态（PIC＜0.25）；卡方适合性检验结果表明，该位点在苏尼特羊和策勒黑羊中均处于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05），在其余4个绵羊品种中则处于哈代温伯格不平衡状态。从表3可知，g.276999C＞T位点在6个绵羊品种中表现为中度多态（0.25＜PIC＜0.5）；卡方适合性检验结果表明，该位点在6个绵羊品种中均处于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05）。

2.2 MKRN3基因2个多态位点与小尾寒羊产羔数的关系 从表4可知，g.275981C＞T位点与g.276999C＞T位点不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间差异不显著（P＞0.05），MKRN3基因2个多态位点不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间均无显著关联。

3 讨 论

表1 MKRN3基因2个多态位点在季节性发情、常年发情绵羊品种中的基因型频率和等位基因频率

表2 MKRN3基因g.275981C＞T 多态位点在不同绵羊品种中的群体遗传学分析

表3 MKRN3基因g.276999C＞T多态位点在不同绵羊品种中的群体遗传学分析

表4 MKRN3基因2个多态位点各基因型小尾寒羊的产羔数

绵羊MKRN3基因位于第15号染色体，属于M蛋白家族[13]。M蛋白家族在物种间的广泛保守性及在发育神经系统中高表达，因此它在细胞中扮演着多个至关重要的角色[14]。大量研究表明，MKRN3基因与蛋白泛素化紧密相关，是信号转导以及调控细胞周期、分化和形态发生的指示剂。MKRN3基因的mRNA表达模式对许多动物青春期的启动具有抑制作用，MKRN3可能作为泛素连接酶在下丘脑水平抑制促性腺激素释放激素（GnRH）的分泌，MKRN3基因变异可导致HPG轴的提前活化[15]。动物繁殖与HPG轴的调控密切相关[16]，HPG轴顶端下丘脑释放GnRH，GnRH以脉冲形式刺激垂体释放黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH），高脉冲GnRH 促进LH 的分泌，反之则诱导FSH的合成，LH分泌升高引起卵泡成熟而排卵[17]。综上所述，MKRN3基因在动物繁殖中的作用十分重要。

本实验中，群体遗传学分析发现，MKRN3基因g.276999C＞T位点在6个绵羊品种中均表现为中度多态，表明其在6个绵羊品种中存在较大的选择潜力。MKRN3基因g.275981C＞T位点在滩羊、湖羊、小尾寒羊和草原型藏羊中处于哈代温伯格不平衡状态，可能是因为自然选择或人工选择对该位点分布影响较大，也可能与本研究选择的羊品种数量较少有关。关联分析结果显示，MKRN3基因g.276999C＞T位点TC型各胎产羔数均高于CC型，推测该位点突变在一定程度上提高了小尾寒羊的产羔能力。

突变能显著改变动物表型，1982年Davis等[18]在澳大利亚布鲁拉绵羊中发现的FecB突变，就是BMPRIB基因的第746位发生A＞G突变导致的，最终显著提高了布鲁拉绵羊的排卵数和产羔数。目前普遍认为MKRN3基因多态性与哺乳动物的生长发育和繁殖有关。汪龙梅等[7]研究表明，猪MKRN3基因g.678T＞C位点与内脂率及臀部膘厚显著相关；Perry等[19]研究表明，人MKRN3基因多个多态位点与青春期时间改变相关。目前MKRN3基因对于绵羊繁殖功能的作用机制尚未明确，故开展绵羊MKRN3基因测序，寻找与产羔数关联的多态位点尤为重要。

本研究在绵羊MKRN3基因上发现的2个多态位点（ g.275981C＞T和 g.276999C＞T）均发生于第 1外显子，g.275981C＞T没有引起氨基酸改变，属于同义突变，但单核苷酸的替换会改变mRNA的剪切效率或准确性，从而影响蛋白质表达水平[20]，同义突变还可以改变mRNA的构象，降低mRNA的稳定性，从而影响多肽链的三维折叠及修饰加工的过程，进一步改变蛋白质的结构或功能，最终对动物表型产生影响[21]。g.276999C＞T属于错义突变，导致第504位氨基酸由脯氨酸变为丝氨酸，错义突变引起氨基酸替代，导致蛋白质一级结构发生改变，从而影响蛋白质或酶的生物学功能[22]。错义突变导致蛋白变化并决定动物表型的变化。因此，MKRN3基因的2个多态位点可能对于绵羊其他生物学功能有一定影响。

4 结 论

本研究筛选出绵羊MKRN3基因新的突变位点g.275981C＞T和g.276999C＞T，两者与小尾寒羊各胎次产羔数之间均没有显著关联，2个多态位点均不适合用于小尾寒羊产羔性状选育。