刘祥辰 董慧玲 孔鹏洲 毕炀辉 贾军梅 宋彬

食管癌是中国高发恶性肿瘤，每年新增病例约30 万，组织学类型以食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）为主［1-2］。由于早期缺乏特异症状，就诊时70%～80%患者已经进入临床中晚期，总5年生存率在15%～25%之间［3］，Ⅲ期患者3年生存率仅10%，Ⅳ期患者3年生存率在5%左右［4］。目前，食管癌的治疗方法主要为手术、化疗、放疗或多学科综合治疗［5］。尽管外科手术和综合治疗取得的进步为ESCC 患者带来生存获益，但其预后仍不佳。经典的联合化疗方案仅可使50%左右的患者得到缓解，其余患者仍对其不敏感，会产生原发性耐药。即使对原方案敏感的患者，经过2～3 个周期化疗后又会出现继发性耐药［6-7］。此外，很多患者对化疗药物的耐药性不仅表现为对已使用药物的耐药，而且对未使用的化疗药物也产生耐药，即多药耐药性［8］，极大地影响了临床疗效。因此，阐明食管癌耐药机制，克服化疗耐药尤其是多药耐药现象，对提高ESCC患者生存率具有重要意义。

铂类抗肿瘤药物包括顺铂（cisplatin，DDP）、奥沙利铂（oxaliplatin，L-OHP）、奈达铂（nedaplatin，NDP）等，是食管癌化疗的常用药物。伴随其在临床的广泛应用，越来越多的食管癌患者表现出对铂类药物的耐药性［9］，已成为ESCC 化疗失败的重要原因。本研究通过建立人体外ESCC L-OHP耐药细胞模型，探索其可能的耐药机制和解决方法，为改善体外ESCC的耐药现状提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人体外ESCC 细胞系KYSE150 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；RPMI1640培养基、CCK-8试剂、蛋白裂解液购自北京索莱宝公司；胰蛋白酶消化液、胎牛血清购自以色列Biological Industries（Bioind）公司；鼠抗人GAPDH 单抗、兔抗人细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase，CDK4）、周期蛋白依赖性激酶6（cyclin-dependent ki⁃nase 6，CDK6）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白E（Cyclin E）多抗购自武汉三鹰公司；鼠抗人视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma，Rb）抗体，兔抗人磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（phospho-retinoblasto⁃ma，p-Rb）抗体购自上海CST公司；注射用L-OHP 购自山东齐鲁制药；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、紫杉醇（Paclitaxel，PTX）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；帕博西尼（palbociclib）购自上海Selleck Chemicals公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人体外ESCC 细胞KYSE150 置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培养基，放置37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。在细胞状态良好、80%融合度时进行传代，磷酸盐缓冲液PBS 清洗1～2 次后，胰蛋白酶消化，完全培养基消化终止，按1:4传代后继续培养。

1.2.2 耐药细胞株KYSE150-OXA 的建立 取对数生长期的KYSE150 细胞，以10 倍半数抑制浓度（50%inhibition concentration，IC50）为诱导剂量用LOHP 诱导培养2 h，然后撤去含药培养基，PBS 漂洗3次，加入正常完全培养基继续培养，每日PBS 清洗去除死细胞并更换新鲜培养基。1周后，培养基中间断加入低浓度L-OHP（IC50 值的1/10～1/5 浓度）继续培养。视细胞状态重复上述加药过程。诱导过程共历时8 个月，最后得到耐药细胞株KYSE150-OXA。SPSS 软件计算药物IC50 值，计算耐药指数。耐药指数（resistance index，RI）=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。

1.2.3 CCK-8 法检测药物对KYSE150 和KYSE150-OXA细胞增殖的影响 选择对数生长期的KYSE150及KYSE150-OXA 细胞，以5×104个细胞/孔的密度接种至96 孔板中，每组设置5 个复孔，培养24 h 后，分别加入终浓度为0、4、8、16、32、64、128、200µmol/L的L-OHP；0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 µg/mL 的PTX；0、100、400、800、1 600、3 200µmol/L的5-FU，处理各组细胞72 h，随后每孔加入10%CCK-8试剂，继续培养1～2 h，酶联免疫检测仪检测450 nm 波长处各孔吸光度（optical density，OD）值，并计算药物对细胞的抑制率：抑制率=（对照组-实验组）/（对照组-空白组）。

1.2.4 流式细胞术 1）细胞周期：制备单细胞悬液，调整细胞密度为1～2×106/mL，70%乙醇4℃固定过夜。次日离心吸除固定液，加入1 mL 预冷的PBS 重悬清洗细胞，离心后弃上清。向沉淀中加入100µL RNaseA 混匀后，加入500µL 碘化丙啶（propidium io⁃dide，PI）染色液混匀，常温孵育30 min，2 h 内进行流式检测；2）细胞凋亡：制备单细胞悬液，以3×105个/孔的细胞密度铺种于6孔板中，24 h 贴壁后，分别加入30µmol/L的L-OHP、0.3µg/mL的PTX、750µmol/L的5-FU共孵育48 h。胰蛋白酶消化细胞，收集1×106个细胞，PBS 重悬清洗1 次，加入200µL 结合缓冲液重悬，再加入5µL Annexin V-FITC 轻轻混匀。加入5µL PI液混匀，室温下避光反应15 min，在1 h内流式细胞仪检测。

1.2.5 Western blot 收集细胞沉淀，PBS 清洗2 次，冰上裂解1 h，4℃、12 000 rpm离心15 min，收集上清，BCA 法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度计算上样体积并加入上样缓冲液，100℃变性5 min，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，一抗4℃过夜。次日TBST洗膜4次，二抗室温孵育2 h，曝光显影。使用Image J 软件分析图像，以目的条带和GAPDH 条带灰度分析值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。数据以表示，KYSE150与耐药细胞KYSE150-OXA1、KYSE150-OXA2及KYSE50-OXA细胞各指标的比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 成功建立人ESCC L-OHP耐药细胞株

收获L-OHP诱导2、5、8个月时的细胞KYSE150-OXA1、KYSE150-OXA2、KYSE150-OXA，CCK8检测各组细胞对L-OHP的耐药性。结果显示：同亲本KYSE150细胞相比，3组耐药细胞株均表现出对L-OHP不同程度的耐药（图1A），耐药指数分别为：2.59±0.26、5.10±0.11、11.23±0.59（图1B），表明L-OHP耐药细胞株建立成功。

由于多药耐药是肿瘤细胞继发性耐药的主要形式，因此本研究分别检测了耐药细胞对PTX和5-FU的IC50值（表1），同亲本相比耐药细胞对5-FU耐药指数2.26±0.23、PTX耐药指数2.04±0.43。

图1 ESCC L-OHP耐药细胞株的建立

表1 PTX、5-FU IC50测定结果 （µM）

另外，本研究将L-OHP、PTX和5-FU处理48 h的细胞应用流式细胞术进行凋亡率检测。结果显示：与亲本KYSE150细胞相比，耐药细胞凋亡率明显降低（表2）。提示除了对L-OHP耐药之外，KYSE150-OXA细胞对PTX和5-FU耐药。Western blot结果也显示耐药细胞株中多药耐药基因1（mul⁃tidrug resistance gene 1，MDR1）表达随着药物诱导浓度的增加而表达量上调，最高较亲本细胞上调（4.46±0.22）倍（图1C），表明耐药细胞具有多药耐药性。

表2 药物处理亲本/耐药细胞凋亡率的比较 （%）

2.2 KYSE150-OXA细胞周期变化

流式细胞术结果显示，与亲代KYSE150 细胞相比，KYSE150-OXA 细胞多处于G1期，S期与G2期细胞数目明显减少（图2A），差异具有统计学意义。提示L-OHP的耐药机制与细胞周期异常密切相关。对细胞周期相关蛋白进行检测发现，随着耐药指数增加，耐药细胞中CDK4、CDK6和CyclinD1的表达显著升高，Cyclin E 表达明显降低（图2B），提示L-OHP 耐药细胞株可能存在CDK4和CDK6的异常激活。

2.3 CDK4/6 抑 制剂palbociclib 逆 转KY150-OXA 对L-OHP的耐药性

为验证CDK4/6 在KYSE150-OXA 耐药机制中的作用，本研究根据L-OHP 作用于亲本KYSE150 细胞的IC50 加入30µmol/L的L-OHP和不同浓度（5、10、20、30、40µmol/L）的palbociclib处理KYSE150和KYSE150-OXA细胞，计算IC50值后，应用CompuSyn软件计算出联合用药指数。本研究发现在palbociclib低浓度时，二者的联合指数＞1，提示palbociclib与L-OHP起拮抗作用。后随palbociclib浓度的增加，联合指数则＜1（图3A），提示二者逐渐转为协同作用。

另外，加入20 µmol/L 的palbociclib 后，与未加palbociclib 组细胞相比，KYSE150-OXA 对L-OHP 的耐药性显著降低，且表现出随palbociclib 浓度升高抑制率升高的趋势（图3B）。提示palbociclib 能够逆转KYSE150-OXA对L-OHP的耐药性。

2.4 palbociclib 通过抑制CyclinD-CDK4/6-pRb 信号通路发挥作用

由于CDK4/6 抑制剂主要通过抑制CDK4/6 的激酶活性，使CyclinD-CDK4/6-pRb 信号通路抑制受阻，从而影响细胞周期正常进行。因此，我们检测了palbociclib 处理前后耐药细胞KYSE150-OXA 中的cyclinD-CDK4/6-pRb 通路相关蛋白表达。结果显示，palbociclib 处理组CDK4/6 的表达无显著变化但pRb表达量降低（91±2）%以及其下游细胞周期蛋白CyclinA表达量降低（89±6）%（图4A，4B），提示palbo⁃ciclib 可能通过抑制异常激活的CyclinD-CDK4/6-pRb通路逆转L-OHP耐药细胞的耐药性。

图2 KYSE150与KYSE150-OXA的细胞周期比较

图3 palbociclib与L-OHP联合使用效果

图4 palbociclib 处理前后耐药细胞中Cyclin D-CDK4/6-pRb 通路相关蛋白表达变化

3 讨论

铂类药物是临床上最为常用的周期非特异性抗肿瘤药物，其抗肿瘤原理是通过铂原子与DNA 链上的G 碱基共价结合形成链内及链间交联，从而使DNA受损，复制受阻，引起肿瘤细胞凋亡［10］。在中国临床肿瘤学会食管癌诊疗指南（2019 版）中，将铂类联合其他化疗药物作为ESCC 一线化疗方案，而LOHP由于其较轻的胃肠道不良反应，常用于晚期ES⁃CC 的化疗方案中。随着铂类药物在ESCC 治疗中的广泛应用，越来越多的ESCC患者表现出对铂类药物的耐药性。

为探究ESCC对L-OHP的耐药机制，本研究建立了人体外ESCC L-OHP耐药细胞株，最高耐药指数达11.23±0.59，提示耐药细胞系构建成功。多药耐药是肿瘤细胞发生耐药的主要形式［11］，本研究结果显示，耐药细胞株KYSE150-OXA表现出了对PTX和5-FU不同程度的耐药性，MDR1 表达明显升高，证实KYSE150-OXA 细胞株多药耐药性的存在。而进一步的研究显示，与亲本细胞相比，耐药细胞株G1期细胞明显增多，S期和G2期细胞明显减少，提示耐药性可能与细胞周期的改变有关。此外，耐药细胞中CDK4、CDK6和Cyclin D1表达升高。Cyclin D是细胞周期蛋白家族的重要成员之一，在DNA合成前期（G1期）与CDK4/6结合并使其激酶活性激活，形成CDK4/6-Cyclin D 复合物。该复合物可使Rb 发生磷酸化，释放与其结合的转录因子E2F，进而使其活化，促进DNA 合成期（S期）所需基因的转录［12］。CDK4/6的异常激活同多种肿瘤的增殖相关，约90%恶性肿瘤中存在Cyclin D1-CDK4/6-Rb 信号通路的异常［13］。ESCC耐药细胞中CDK4、CDK6表达升高，提示二者可能在食管癌耐药中发挥重要作用。

palbociclib是目前广泛应用于肿瘤治疗的CDK4/6特异性抑制剂，其主要作用机制是靶向抑制CDK4/6的活性，阻止肿瘤细胞过度增殖。其不仅可以单独使用，也可与其他药物联用增强信号通路靶点抑制剂的效力［14］。有临床研究结果显示，乳腺癌中CDK4/6与PI3K 抑制剂［15］、激素受体拮抗剂来曲唑［16］联用效果显著；与mTOR、MEK、FGFR、BTK和RTK等靶点抑制剂联用也有较好的临床效果［14，17-18］。鉴于CDK4/6抑制剂的上述特点，本研究提出了CDK4/6 抑制剂palbociclib 与L-OHP 联用可以逆转耐药细胞对LOHP耐药性的假设。结果显示，加入palbociclib组的KYSE150-OXA 对L-OHP 的敏感性增加。而该作用的发挥可能是通过抑制CDK4/6 的激酶活性，使异常激活的Cyclin D-CDK4/6-pRb信号通路转导受阻，使细胞周期恢复正常，阻止肿瘤细胞对化疗药的逃逸作用。另外，本研究还发现，低浓度的palbociclib 与L-OHP联用会产生拮抗作用，但伴随palbociclib的浓度增加，其与L-OHP 的协同作用逐渐增强，提示pal⁃bociclib的临床使用必须规范，确保palbociclib达到一定程度的血药浓度，使患者获得最佳的治疗效益。

本研究成功建立了人体外ESCC L-OHP 耐药模型，并借助此模型发现，CDK4/6蛋白表达量在耐药细胞中显著升高。palbociclib 可能通过抑制异常激活的Cyclin D-CDK4/6-pRb 信号通路，逆转人体外ES⁃CC L-OHP 耐药细胞对L-OHP 的耐药性。本研究为筛选具有抗肿瘤作用的化疗方案，改善ESCC的耐药提供了依据。